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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole expérimental décrit et optimise une méthode de coloration par immunohistochimie multiplex (IHC), principalement en optimisant les conditions d’incubation des anticorps monocanal et en ajustant les paramètres des anticorps et des canaux pour résoudre les problèmes d’autofluorescence et de diaphonie des canaux dans les tissus cancéreux du poumon d’origine clinique.

Résumé

Le cancer du poumon est la principale cause de morbidité et de mortalité liées aux tumeurs malignes dans le monde entier, et le microenvironnement tumoral complexe a été considéré comme la principale cause de décès chez les patients atteints de cancer du poumon. La complexité du microenvironnement tumoral nécessite des méthodes efficaces pour comprendre les relations entre cellules dans les tissus tumoraux. La technique d’immunohistochimie multiplex (mIHC) est devenue un outil clé pour inférer la relation entre l’expression des protéines en amont et en aval des voies de signalisation dans les tissus tumoraux et développer des diagnostics cliniques et des plans de traitement. mIHC est une méthode de coloration par immunofluorescence multi-marques basée sur la technologie d’amplification du signal tyramine (TSA), qui peut détecter simultanément plusieurs molécules cibles sur le même échantillon de coupe de tissu pour réaliser différentes analyses de co-expression et de co-localisation des protéines. Dans ce protocole expérimental, des coupes tissulaires enrobées de paraffine d’un carcinome épidermoïde pulmonaire d’origine clinique ont été soumises à une coloration immunohistochimique multiplexe. En optimisant le protocole expérimental, la coloration immunohistochimique multiplex des cellules et protéines cibles marquées a été réalisée, résolvant le problème de l’autofluorescence et de la diaphonie des canaux dans les tissus pulmonaires. De plus, la coloration immunohistochimique multiplex est largement utilisée dans la validation expérimentale du séquençage à haut débit lié aux tumeurs, y compris le séquençage unicellulaire, la protéomique et le séquençage de l’espace tissulaire, fournissant des résultats de validation pathologique intuitifs et visuels.

Introduction

L’amplification du signal de la tyramine (TSA), qui a une histoire de plus de 20 ans, est une classe de techniques de dosage qui utilisent la peroxydase de raifort (HRP) pour le marquage in situ à haute densité des antigènes cibles et est largement appliquée dans les tests immuno-enzymatiques (ELISA), l’hybridation in situ (ISH), l’immunohistochimie (IHC) et d’autres techniques de détection des antigènes biologiques. Améliorer considérablement la sensibilité du signal détecté1. La coloration polychromatique opale basée sur la technologie TSA a été récemment développée et largement utilisée dans plusieurs études 2,3,4,5. La coloration traditionnelle par immunofluorescence (FI) fournit aux chercheurs un outil facile pour la détection et la comparaison de la distribution des protéines dans les cellules et les tissus de divers organismes modèles. Elle est basée sur la liaison spécifique aux anticorps et à l’antigène et comprend des approches directes et indirectes6. L’immunocoloration directe implique l’utilisation d’un anticorps primaire conjugué au fluorophore contre l’antigène d’intérêt, ce qui permet une détection directe par fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence. L’approche d’immunomarquage indirect implique l’application d’un anticorps secondaire conjugué au fluorophore contre l’anticorps primaire non conjugué 6,7.

Les méthodes traditionnelles de coloration par immunofluorescence à marquage unique ne peuvent colorer qu’un, deux ou, dans certains cas, trois antigènes dans les tissus, ce qui constitue une limitation majeure dans l’exploitation des riches informations contenues dans les coupes tissulaires. L’interprétation des résultats quantitatifs dépend souvent de l’observation visuelle et d’une quantification précise par un logiciel d’imagerie, tel qu’ImageJ. Il existe des limites techniques, telles que la restriction des espèces d’anticorps, la faiblesse des signaux d’étiquetage fluorescents et le chevauchement des couleurs des colorants fluorescents (tableau 1). La technique Opal multiplex IHC (mIHC) est basée sur la dérivation TSA, qui permet la coloration multiplex et le marquage différentiel de plus de 7 à 9 antigènes sur la même section de tissu, sans restriction sur l’origine de l’anticorps primaire, mais nécessite une spécificité élevée de l’anticorps correspondant contre l’antigène. La procédure de coloration est similaire à celle de la coloration par immunofluorescence normale, à deux différences près : chaque cycle de coloration implique l’utilisation d’un seul anticorps et une étape d’élution d’anticorps est ajoutée. Les anticorps liés à l’antigène par des liaisons non covalentes peuvent être éliminés par élution par micro-ondes, mais le signal fluorescent TSA lié à la surface de l’antigène par des liaisons covalentes est conservé.

Les molécules de tyramine (T) activées marquées avec le colorant sont fortement enrichies au niveau de l’antigène cible, ce qui permet une amplification efficace du signal fluorescent. Cela permet un marquage direct de l’antigène sans interférence d’anticorps, puis un marquage multicolore peut être obtenu après plusieurs cycles de coloration 8,9,10 (Figure 1). Bien que cette technologie produise des images fiables et précises pour l’étude des maladies, la création d’une stratégie de coloration par immunohistochimie fluorescente multiplex (mfIHC) utile peut prendre du temps et être exigeante en raison de la nécessité d’une optimisation et d’une conception approfondies. Par conséquent, ce protocole de panel multiplex a été optimisé dans un colorateur IHC automatisé avec un temps de coloration plus court que celui du protocole manuel. Cette approche peut être directement appliquée et adaptée par tout chercheur pour des études d’immuno-oncologie sur des échantillons de tissus humains fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE)11. De plus, les méthodes de préparation des lames, d’optimisation des anticorps et de conception multiplex seront utiles pour obtenir des images robustes qui représentent des interactions cellulaires précises in situ et pour raccourcir la période d’optimisation de l’analyse manuelle12.

Le mfIHC comprend principalement l’acquisition d’images et l’analyse de données. En termes d’acquisition d’images, les échantillons multicolores marqués et colorés doivent être détectés avec un équipement d’imagerie spectrale professionnel pour identifier les différents signaux de couleurs mélangées et obtenir des images signal/bruit élevées sans interférence de l’autofluorescence tissulaire. Les équipements actuels d’imagerie spectrale comprennent principalement des microscopes confocaux spectraux et des systèmes d’imagerie tissulaire multispectrale. Le système d’imagerie tissulaire multispectrale est un système d’imagerie professionnel conçu pour l’analyse quantitative de coupes de tissus, et sa caractéristique la plus importante est l’acquisition d’informations spectrales d’image, qui fournissent à la fois des informations sur la structure morphologique et la cartographie optique des échantillons de tissus biologiques13,14. Tout pixel de l’image spectrale contient une courbe spectrale complète, et chaque colorant (y compris l’autofluorescence) a son spectre caractéristique correspondant, ce qui permet l’enregistrement complet et l’identification précise des signaux multi-étiquettes mélangés et superposés.

En termes d’analyse des données, les échantillons marqués multicolores sont extrêmement complexes en raison de la structure morphologique et des cellules constitutives des échantillons de tissus. Les logiciels ordinaires ne peuvent pas identifier automatiquement différents types de tissus. Par conséquent, un logiciel intelligent d’analyse quantitative tissulaire est utilisé pour l’analyse quantitative de l’expression de l’antigène dans des régions spécifiques 15,16,17,18.

Par-dessus tout, la coloration par immunofluorescence multimarque fusionnée à l’imagerie multispectrale et à la technologie d’analyse pathologique quantitative présente les avantages d’un grand nombre de cibles de détection, d’une coloration efficace et d’une analyse précise, et elle peut donc améliorer considérablement la précision de l’analyse histomorphologique, révéler la relation spatiale entre les protéines avec une résolution au niveau cellulaire et aider à extraire des informations plus riches et plus fiables à partir d’échantillons de coupes de tissus19 (Tableau 1).

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Protocole

Le protocole est approuvé par les directives du comité d’éthique de l’hôpital de Chine occidentale, Université du Sichuan, Chine. Les échantillons de tissu cancéreux du poumon ont été obtenus lors d’une intervention chirurgicale au Centre du cancer du poumon de l’hôpital de Chine occidentale, et le consentement éclairé de chaque patient a été obtenu.

1. Préparation de la coupe de tissu

  1. Préparation FFPE
    1. Immerger les tissus cliniques dans une solution neutre de formol pendant plus de 72 h.
    2. Terminer le processus de déshydratation des tissus à l’aide de xylène et de solutions alcooliques graduées20.
    3. Effectuez un enrobage manuel de paraffine et une coupe de tissu à une épaisseur de section de 4 μm. Utilisez des lames de microscope à adhérence pour vous assurer que les tranches de tissu ne tombent pas.
    4. Cuire les lames dans un four à 65 °C pendant 2 h pour s’assurer que le tissu et les lames sont secs. Conserver dans une boîte à lames à température ambiante.
  2. Prétraitement de la coupe tissulaire
    1. Prétraiter les lames de tissu dans un four à 65 °C pendant 5 min, puis les immerger séquentiellement dans des solutions de xylène pendant 2 x 15 min, des solutions d’éthanol anhydre pendant 2 x 15 min, une solution d’éthanol à 90 % pendant 10 min, une solution d’éthanol à 85 % pendant 10 min, une solution d’éthanol à 80 % pendant 10 min et une solution d’éthanol à 75 % pendant 10 min, suivi du lavage des lames à l’eau stérilisée pendant 3 x 1 min.
      REMARQUE : Cette technique expérimentale ne peut être utilisée que pour les tissus FFPE, et non pour les tissus congelés ou frais, car le processus de réparation d’antigènes multiples à haute température fait tomber le tissu de la lame.

2. Optimisation de l’anticorps primaire

REMARQUE : Des expériences IHC conventionnelles ont été utilisées pour déterminer les conditions d’incubation des anticorps individuels, y compris principalement la concentration d’anticorps et les conditions de réparation de l’antigène. Reportez-vous aux conditions du manuel d’instructions de l’anticorps.

  1. Utilisez une concentration d’anticorps légèrement supérieure à la plage de concentration recommandée et aux valeurs intermédiaires.
  2. Optimiser les routines tampons de récupération d’antigènes PH6 et PH9 en fonction de l’emplacement d’expression de la protéine. Utilisez PH9 pour les protéines exprimées dans le noyau et utilisez l’une ou l’autre routine (PH6 ou PH9) pour les autres protéines.

3. Méthode de coloration mIHC

REMARQUE : La coloration mIHC de l’opale est l’une des méthodes mIHC disponibles. Dans ce protocole expérimental à 5 couleurs, chaque échantillon de tissu doit être coloré avec quatre anticorps, quatre incubations d’anticorps primaires, des incubations d’anticorps secondaires et des incubations chromogènes d’amplification du signal TSA, ainsi que cinq restaurations d’antigènes sont nécessaires. Enfin, la coloration au 4'6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et le scellement de l’agent d’éclatement anti-fluorescent sont effectués.

  1. Préparation du réactif principal
    REMARQUE : Déterminer la quantité de réactif à ajouter en fonction de la taille des lames de tissu. Utilisez suffisamment de volume pour couvrir complètement la section de tissu (généralement, 50 à 150 μL par lame). Les solutions de travail nécessaires à l’expérience sont préparées comme suit :
    1. Solution de travail du tampon de lavage : diluer 20x Wash buffer à 1:20 avec de l’eau bi-distillée et conserver à température ambiante.
    2. Solution de travail tampon PH6 : Diluer 100x tampon PH6 à 1:100 avec de l’eau doublement distillée. Préparer avant utilisation et conserver à température ambiante.
    3. Solution de travail tampon PH9 : Diluer 50x tampon PH9 à 1:50 avec de l’eau doublement distillée. Préparer avant utilisation et conserver à température ambiante.
    4. HRP polymère : Préparez cette solution prête à l’emploi uniquement pour les anticorps primaires d’origine lapine et souris.
    5. Solution de travail fluorophore : Reconstituer chaque poudre de fluorophore (sauf fluorophore 780) dans 75 μL de DMSO. Avant chaque intervention, diluer le fluorophore dans 1x diluant d’amplification à 1:100. Jetez toute partie inutilisée de la solution de travail au fluorophore.
    6. Solution de travail Fluorophore 780 : Reconstitution du TSA-DIG dans 75 μL de DMSO et de la poudre de fluorophore 780 dans 300 μL d’eau doublement distillée. Avant l’intervention, diluer TSA-DIG dans un diluant d’amplification 1x à 1:100, et diluer le fluorophore 780 avec un diluant Ab à 1:25.
    7. Solution de travail DAPI : Diluez la solution DAPI à 1:50 avec de l’eau bidistillée ou du PBS. Préparer avant utilisation et conserver à 4 °C pendant 48 h maximum.
      NOTE. Lavez les lames uniquement avec de l’eau doublement distillée et une solution de travail de tampon de lavage fraîchement préparée tout au long de cette expérience de coloration par fluorescence multi-étiquettes. Les coupes de tissu ne doivent pas entrer en contact avec l’eau du robinet ; Les contaminants présents dans l’eau du robinet peuvent adhérer aux sections de tissu et provoquer une autofluorescence. Gardez les échantillons à l’abri de la lumière tout au long de l’expérience.
  2. Prélèvement d’antigènes
    1. Placez les lames dans une boîte de coloration et de réparation et remplissez-la de solution tampon PH6 ou PH9, couvrez avec le couvercle et faites chauffer au four à micro-ondes pendant 2 x 8 min à 100% de puissance.
      REMARQUE : Ajoutez de l’eau doublement distillée dans la boîte de réparation pendant le processus de chauffage pour éviter une évaporation excessive qui peut provoquer le dessèchement des tranches.
    2. Laisser refroidir les lames à température ambiante avant de continuer (30-60 min).
    3. Lavez les lames 3 x 2 min avec de l’eau doublement distillée. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour encercler la section de tissu sur la lame.
  3. Bloquant
    1. Immerger les sections de tissu dans le tampon de lavage, couvrir de solution de blocage et incuber les lames dans une chambre humidifiée à température ambiante pendant 10 minutes.
  4. Incubation primaire des anticorps
    1. Retirez la solution bloquante des lames et couvrez les sections de tissu avec la solution de travail d’anticorps primaire. Incuber les lames dans une chambre humidifiée pendant 1 h à 37 °C dans l’incubateur ou une nuit à 4 °C au réfrigérateur.
      REMARQUE : Ne laissez pas les lames se dessécher.
  5. Introduction du polymère HRP
    1. Laver les lames dans une solution de travail tampon de lavage pendant 3 x 2 min. Ajouter le polymère HRP directement goutte à goutte sur les sections de tissu et incuber pendant 15 min à température ambiante.
      REMARQUE : Pour les lames conservées au réfrigérateur, conservez-les à température ambiante pendant environ 30 minutes avant de les laver pour éliminer l’anticorps primaire.
  6. Génération d’amplification du signal de tyramine (TSA)
    1. Lavez la lame avec la solution de travail du tampon de lavage pendant 3 x 2 min, ajoutez la solution de travail fluorophore directement goutte à goutte sur les sections de tissu et incubez pendant 10 min à température ambiante. Lavez la diapositive avec la solution de travail du tampon de lavage pendant 3 x 2 min.
  7. Procédure spéciale pour fluorophore 780
    REMARQUE : Le fluorophore 780 est faible et est systématiquement placé en dernier dans le schéma de correspondance des couleurs de toute l’expérience. Le fluorophore 780 n’est normalement pas utilisé dans ce protocole expérimental, mais en raison de sa spécificité, ses étapes expérimentales sont répertoriées.
    1. Introduction de TSA-DIG
      1. Lavez la lame avec la solution de travail du tampon de lavage pendant 3 x 2 min, ajoutez la solution de travail TSA-Drg goutte à goutte sur les sections de tissu et incubez pendant 10 min à température ambiante.
    2. Traitement par micro-ondes
      1. Lavez les lames avec la solution de travail tampon de lavage pendant 3 x 2 min.
      2. Placez les lames dans une boîte de teinture et de réparation, remplissez-la de solution réparatrice, couvrez avec le couvercle et faites chauffer au four à micro-ondes pendant 2 x 8 min à 100% de puissance. Laisser refroidir les lames à température ambiante avant de continuer (30-60 min).
      3. Lavez les lames pendant 3 x 2 min avec de l’eau doublement distillée.
    3. Génération de signaux Fluorophore 780
      1. Immerger les sections dans un tampon de lavage, recouvrir de solution de travail fluorophore 780 et incuber les lames dans une chambre humidifiée pendant 1 h à température ambiante.
      2. Lavez les lames avec la solution de travail tampon de lavage pendant 3 x 2 min.
        REMARQUE : NE PAS effectuer de traitement par micro-ondes après cette étape.
    4. Utilisez le fluorophore 780 comme dernière étape de l’ensemble du flux de travail, puis colorez les noyaux directement avec la solution de travail DAPI.
      REMARQUE : Sautez l’étape 3.7 si vous n’utilisez pas de fluorophore 780.
  8. Traitement par micro-ondes
    REMARQUE : Cette étape micro-ondes élimine le complexe HRP primaire-secondaire et réexpose les antigènes, permettant l’introduction de l’anticorps primaire suivant.
    1. Placez les lames dans une boîte de coloration et de réparation, remplissez-la de solution tampon PH6 ou PH9, couvrez avec le couvercle et faites chauffer au four à micro-ondes pendant 2 x 8 min à 100% de puissance.
    2. Laisser refroidir les lames à température ambiante avant de continuer (30-60 min). Lavez les lames 3 x 1 min avec de l’eau doublement distillée.
    3. Tremper les lames dans la solution de travail du tampon de lavage pendant 2 min. Effectuez la prochaine incubation d’anticorps.
  9. Incubation suivante des anticorps
    1. Répétez les étapes 3.2 à 3.8 (sauf l’étape 3.7).
  10. Coloration nucléaire cellulaire et scellement tissulaire
    1. Couvrir les sections de tissu avec la solution de travail DAPI et incuber les lames dans une chambre humidifiée pendant 5 min à température ambiante. Lavez les lames pendant 3 x 2 min avec de l’eau doublement distillée.
    2. Retirez les gouttelettes d’eau des lames, ajoutez 10 à 20 μL de produit anti-fluorescence sur chaque lame et scellez les lames avec un verre de protection pour microscope.
    3. Stockez les lames finies à 4 °C, à l’abri de la lumière, pendant plus d'1 mois.
      REMARQUE : Veillez à éviter les bulles d’air.

4. Configurez le contrôle négatif

  1. Traitez les lames de contrôle négatif comme les lames contenant des tissus, mais sans ajouter de réactifs tels que des anticorps primaires, des anticorps secondaires, des réactifs TSA et du DAPI, qui sont utilisés pour éliminer l’autofluorescence tissulaire lors de la numérisation du film.

5. Numérisation entièrement automatique des lames de tissus

REMARQUE : L’équipement utilisé pour l’imagerie spectrale est un analyseur de quantification tissulaire multispectrale entièrement automatisé, et la visualisation de l’imagerie et de l’analyse des lames 5 couleurs peut être effectuée à l’aide du système référencé (voir Tableau des matériaux). Le système utilise l’imagerie multispectrale pour le démélange quantitatif de plusieurs fluorophores et l’autofluorescence tissulaire.

  1. Réglez manuellement le temps d’exposition et le programme de balayage pour chaque canal de fluorescence et confirmez que l’instrument a terminé l’exposition et le balayage entièrement automatiques des lames de tissu.
    REMARQUE : La surface de la diapositive doit être propre et exempte de film d’eau. Attention à la quantité de scellant : trop de lamelles feront glisser la lamelle et l’instrument signalera une erreur.

6. Analyse de la fluorescence

  1. Double-cliquez sur le logiciel (voir la Table des matériaux), faites glisser le fichier image de fluorescence multicolore obtenu à partir de la numérisation d’origine dans le logiciel et définissez le type d’image sur fluorescence.
  2. Cliquez sur le bouton Luminosité et contraste et vérifiez les canaux sur le panneau. Cliquez à l’extérieur, puis sur le canal pour sélectionner le canal de fluorescence qui vous intéresse. Faites glisser l’affichage Min et l’affichage Max pour régler la luminosité et le contraste de chaque canal.
  3. Après l’analyse, déterminez la vue à enregistrer, cliquez sur Afficher la vue d’ensemble de la diapositive et Afficher l’emplacement du curseur pour supprimer ces deux contenus, conservez la barre d’échelle, puis cliquez sur Fichier | Exporter un instantané | Contenu de la visionneuse actuelle pour exporter un fichier png.
    REMARQUE : Chaque canal de fluorescence et une figure fusionnée doivent être exportés pour une analyse ultérieure.
  4. Pour une analyse plus approfondie de la positivité des cellules cibles, utilisez un logiciel d’identification et de segmentation des cellules21 (voir Tableau des matériaux).

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Résultats

Nous avons optimisé le schéma d’appariement des anticorps primaires CD8 et des fluorophores. Les deux séries de résultats de fluorescence correspondaient exactement aux mêmes conditions d’incubation d’anticorps dans le groupe expérimental, à l’exception du changement du fluorophore apparié aux anticorps. Comme le montre la figure 2, il y avait une différence significative dans l’appariement des canaux des lymphocytes T CD8+ avec le fluorophore 480 et le fluorophore 690. Le...

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Discussion

La mIHC est une technique expérimentale indispensable dans le domaine de la recherche scientifique pour l’analyse quantitative et spatiale de plusieurs marqueurs protéiques au niveau de la cellule unique dans une seule coupe de tissu, fournissant des données intuitives et précises pour l’étude de la pathologie de la maladie en se concentrant sur la structure tissulaire détaillée et les interactions cellulaires dans le contexte du tissu d’origine. L’adoption généralisée de la technologie mIHC nécessiter...

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Déclarations de divulgation

Tous les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier les membres de l’Institut de recherche en pathologie clinique de l’hôpital de Chine occidentale, qui ont fourni des conseils techniques pour l’immunofluorescence multiplex de qualité et le traitement IHC. Ce protocole a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82200078).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Anti-CD8Abcamab237709Primary antibody, 1/100, PH9
Anti-CD68Abcamab955Primary antibody, 1/300, PH9
Anti-CK5/6MilliporeMAB1620Primary antibody, 1/150, PH9
Anti-HMGCS1GeneTexGTX112346Primary antibody, 1/300, PH6
Animal nonimmune serumMXB BiotechnologiesSP KIT-B3Antigen blocking
Fluormount-GSouthernBiotech0100-01Anti-fluorescent burst
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC KitAkoyaNEL861001KTOpal mIHC Staining
Wash BufferDakoK8000/K8002/K8007/K8023Washing the tissues slides
Software
HALOintelligent quantitative tissue analysis software, paid software
inFormintelligent quantitative tissue analysis software, paid software
PerkinElmer Vectramultispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.
QuPath 0.3.2intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.

Références

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