Un modèle de rat d’acné composée

Résumé

Ce protocole décrit la procédure d’induction de l’inflammation de l’acné dans la peau du rat avec de l’acide oléique et Cutibacterium acnes.

Résumé

L’acné vulgaire est une affection cutanée chronique répandue caractérisée par la présence de comédons, de papules et de pustules sur le visage, le cou et la poitrine. Pour simuler l’inflammation de l’acné vulgaire, ce protocole détaille une approche visant à établir un modèle composé d’acné chez les rongeurs en induisant une inflammation de l’acné dans les oreilles de rat à l’aide d’acide oléique et de Cutibacterium acnes (C. acnes). Les rats ont été divisés au hasard en quatre groupes : le groupe témoin normal (NC), les oreilles traitées au groupe acide oléique (OA), les oreilles traitées au groupe C. acnes (C. acnes), les oreilles traitées à l’acide oléique et C . acnes (OA + C. acnes). Pour imiter la production excessive de sébum, de l’acide oléique a été étalé sur les oreilles de rats des groupes OA et OA + C. acnes pendant 25 jours.

Du 21e au 25e jour, la suspension de C. acnes a été injectée par voie intradermique dans les oreilles de rats des groupes C. acnes et OA + C. acnes pour aggraver l’inflammation de l’acné. L’épaisseur de l’oreille a été mesurée chaque semaine comme indicateur de la gravité de l’inflammation. L’observation macroscopique, la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, et l’immunohistochimie (IHC) ont été réalisées et les résultats ont montré que les oreilles du groupe OA et du groupe OA + C. acnes étaient épaissies et indurées, accompagnées d’un érythème et de la présence de comédons. De plus, des papules ont été observées dans les groupes C. acnes et OA + C. acnes . L’histopathologie a montré une hyperkératinisation et une expansion de l’infundibulum des follicules pileux dans les groupes OA et OA + C. acnes . Des infiltrations de cellules inflammatoires et des abcès ont été retrouvées dans le derme des groupes C. acnes et OA + C. acnes . Les résultats de l’IHC ont confirmé l’augmentation des taux de facteur de nécrose tumorale (TNF)-α dans le derme des groupes C. acnes et OA + C. acnes . Tous les résultats ci-dessus ont collectivement indiqué l’établissement réussi du modèle composé d’acné chez les rongeurs.

Introduction

L’acné vulgaire est une maladie chronique courante de la peau caractérisée par la présence de comédons, de papules et de pustules sur le visage, le cou et la poitrine, qui, dans les cas graves, peuvent évoluer vers des nodules, des kystes et des cicatrices permanentes¹. Des études épidémiologiques indiquent que l’acné touche 9,4 % de la population mondiale, tandis que les symptômes qui en résultent posent de graves défis physiques et^{psychosociaux2,3}.

La pathogenèse de l’acné est multifactorielle, comprenant quatre processus critiques : la production excessive de sébum, la formation de comédons, la colonisation folliculaire par le microbiote cutané et la libération de médiateurs inflammatoires autour de l’unité pilo-sébacée ^4,5. L’augmentation de la sécrétion de sébum, entraînant l’accumulation d’un excès d’acides gras libres insaturés (AGFI), contribue à la reproduction anormale du microbiote cutané, dont Cutibacterium acnes, comme le montrent les études génomiques⁶. Pendant ce temps, le microbiote cutané décompose le sébum et augmente la concentration d’UFFA, entraînant un cercle vicieux⁷. De plus, l’excès d’UFFA provoque une hyperkératinisation des follicules pileux, qui à son tour déclenche l’acné⁸. Le microbiote cutané et l’augmentation du sébum activent tous deux les récepteurs de type Toll (TLR) pour produire de multiples cytokines pro-inflammatoires telles que l’interleukine (IL)-1 et le TNF-α ^9,10. Cette cascade d’inflammation, associée à une augmentation du sébum et à une prolifération microbienne, culmine dans une hyperkératose prononcée du follicule pileux et l’apparition de l’acné¹¹.

Le développement rapide dans le domaine de la recherche sur l’acné et les exigences cliniques connexes ont conduit à la création d’une série de modèles animaux d’inflammation de l’acné sur l’oreille de rat, le dos de rats ou de souris et l’oreille de lapin 12,13,14,15. Les méthodes comprennent l’injection intradermique de C. L’acné, l’application d’huiles sur la peau pour simuler la sécrétion anormale des glandes sébacées et l’hyperkératinisation, ou une combinaison des deux pour accélérer l’inflammation de la peau pour former de l’acné 16,17,18,19. Cependant, l’utilisation et le dosage des agents chimiques et biologiques varient entre les études précédentes, ce qui peut dérouter les chercheurs ayant l’intention d’établir un modèle d’acné approprié. Cette étude visait à établir une méthode facile à utiliser et efficace pour former un modèle composé d’acné chez les rongeurs et à fournir un modèle de référence pour les chercheurs qui étudient l’acné vulgaire.

Protocole

Ce protocole a reçu l’approbation éthique de l’Université de médecine chinoise de Pékin (n° 2023033103-1183). Douze rats Sprague-Dawley mâles (poids, 208 g ± 5 g) ont été utilisés dans ce protocole et divisés en quatre groupes : groupe NC (n = 3), groupe OA (n = 3), groupe C. acnes (n = 3) et groupe OA + C. acnes (n = 3).

1. Développer le modèle de l’acné

1. Mesurez et enregistrez l’épaisseur des oreilles de rat à l’aide d’un pied à coulisse électronique (voir Tableau des matériaux) avant la modélisation.
   1. Placez la mâchoire externe de l’étrier vernier électronique au milieu du bord extérieur de l’oreille et prolongez-la dans le conduit auditif. Notez l’épaisseur de 2/3 points et l’épaisseur de 1/2 points le long de la ligne. Mesurez chaque point 3x et calculez les valeurs moyennes de l’épaisseur de deux points pour être considéré comme l’épaisseur de l’oreille.
2. Inclinez la tête du rat d’un côté, faites face à l’oreille vers le haut et appliquez 50 μL d’acide oléique (voir le tableau des matériaux) sur les côtés ventral et dorsal de l’oreille uniformément, une fois par jour, pendant 25 jours.
3. Du 21e au 25e jour, avant l’application d’acide oléique, anesthésier les rats à l’aide d’isoflurane à 4 %, puis injecter 50 μL de suspension de C. acnes de 1 × 10 à⁷ UFC (voir le Tableau des matières) par voie intradermique dans la surface ventrale de l’oreille à l’aide d’une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 34 G ou de 36 G (voir le Tableau des matériaux).
   REMARQUE : Veillez à éviter les vaisseaux sanguins dans l’oreille lors de l’injection intradermique. Une micro-seringue avec une aiguille de 34 G ou 36 G (voir tableau des matériaux) est nécessaire. Pour assurer une bonne injection intradermique, l’aiguille doit être perforée à un angle de 10 à 15 degrés, avec une profondeur d’environ 1 mm.
4. Le 25e jour, mesurez et notez l’épaisseur des oreilles, comme décrit à l’étape 1.1.
   REMARQUE : Le groupe OA a été uniquement enduit d’acide oléique tel que décrit à l’étape 1.2 et injecté avec une solution saline du 21e au 25e jour. Le groupe C. acnes n’a été injecté par voie intradermique que par une suspension de C. acnes , comme décrit à l’étape 1.3. Le groupe OA + C. acnes a été traité avec de l’acide oléique et une suspension de C. acnes , comme décrit aux étapes 1.2 et 1.3.

2. Prélèvement et analyse des tissus

1. Le 26e jour, après que les rats ont été euthanasiés sans cruauté à l’aide d’une méthode approuvée par l’établissement, forets de taille fixe sur des oreilles bilatérales à l’aide d’un foret à anneau de 8 mm.
2. Immerger les tissus de l’oreille dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h, puis incorporer de la paraffine et sectionner en tranches de 5 m d’épaisseur pour une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE)²⁰. Observez les coupes au microscope optique et enregistrez les changements pathologiques pour une évaluation de suivi par un pathologiste. Attribuez des scores aux changements pathologiques conformément au tableau 1 (voir également la figure 1).
3. Déparaffiniser, réhydrater et chauffer les sections pour la récupération de l’antigène. Inactiver les peroxydases endogènes par incubation avec 0,3% de_H2O2 dans du méthanol pendant 15 min à température ambiante.
4. Lavez les sections avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis incubez-les avec 3% de BSA pendant 30 min à température ambiante.
5. Incuber les sections avec l’anticorps monoclonal TNF-α (dilution 1:800) (voir le tableau des matériaux) à 4 °C pendant la nuit.
6. Lavez à nouveau les sections avec du PBS et incubez avec l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (voir le tableau des matériaux) pendant 50 min.
7. Après un autre lavage PBS, appliquez un mélange de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) sur les lames et surveillez le processus de coloration au microscope, en arrêtant la réaction avec le PBS lorsque l’intensité souhaitée est atteinte.
8. Contre-colorez les sections avec de l’hématoxyline de Meyer pendant 1 min, rincez-les à l’eau courante, puis déshydratez et montez les sections. Observez les coupes au microscope et enregistrez les changements pathologiques pour une évaluation de suivi par un pathologiste.

3. Analyse statistique

1. Effectuer des analyses statistiques.
2. Présentez les données sous forme de moyenne ± d’écart-type. Accédez à la normalité de toutes les données à l’aide du test Shapro-Wilke. S’il suit une distribution normale, utilisez l’ANOVA à un facteur pour évaluer les différences significatives. Pour les données non distribuées normalement, appliquez le test de Kruskal-Wallis suivi des comparaisons multiples de Dunn. Une valeur p inférieure à 0,05 est considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Épaisseur et aspect de la peau
Du jour 7 au jour 21, les oreilles du groupe OA et du groupe OA + C. acnes étaient significativement plus épaisses que celles des groupes NC et C. acnes . Au jour 25, les oreilles du groupe OA, du groupe C. acnes et du groupe OA + C. acnes étaient significativement plus épaisses que celles du groupe NC (p < 0,05). L’épaisseur moyenne des oreilles pendant l’expérience est illustrée ...

Discussion

La méthodologie et les critères d’évaluation d’un modèle d’acné n’étant pas clairs, ce protocole visait à fournir une référence aux chercheurs étudiant l’acné. En raison de la petite taille de l’oreille de souris et de l’interférence causée par la croissance des poils sur le dos, l’utilisation d’une crème dépilatoire et d’un rasoir, l’oreille du rat peut être une meilleure alternative pour établir un modèle d’acné chez les rongeurs. Nous avions ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anaero-indicator	Mitsubishi, Japan	C-22
AnaeroPack	Mitsubishi, Japan	C-11, C-41
Columbia blood agar plate	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Constant temperature incubator	SHANGCHENG, China	303-0
Cotton swab	HYNAUT, China	_
Cutibacterium acnes	BeNa Cuture Collection, China	BNCC330605
Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase/DAB+, Rabbit/Mouse	DAKO, Denmark	K5007
disposable sterile injection needle	Zhejiang Oujian Medical Apparatus, China	_
Electronic scale	JINXUAN, China	A017
Electronic vernier caliper	Deli, China	DL90150
Oleic acid (Analytical reagent, AR)	Fangzheng, China	_
Sodium chloride injection	CR Double CRANE, China	Y2212241
SPSS Statistics	IBM, USA	26.0
sterile hypodermic syringes	Shandong weigao group medical polymer, China	_
TNF Alpha Monoclonal antibody	Proteintech Group,int, USA	60291-1-lg