Établissement d’un modèle physiologique de micro-tumeurs vascularisées humaines pour la recherche sur le cancer

Résumé

Ce protocole présente un modèle de tumeur sur puce physiologiquement pertinent pour effectuer des recherches fondamentales et translationnelles à haut débit sur le cancer humain, en faisant progresser le dépistage des médicaments, la modélisation des maladies et les approches de médecine personnalisée avec une description des procédures de chargement, d’entretien et d’évaluation.

Résumé

L’absence de modèles de cancer validés qui récapitulent le microenvironnement tumoral des cancers solides in vitro reste un goulot d’étranglement important pour la recherche préclinique sur le cancer et le développement thérapeutique. Pour surmonter ce problème, nous avons développé la microtumeur vascularisée (VMT), ou puce tumorale, un système microphysiologique qui modélise de manière réaliste le microenvironnement complexe de la tumeur humaine. La VMT se forme de novo au sein d’une plate-forme microfluidique par co-culture de plusieurs types de cellules humaines dans des conditions d’écoulement dynamiques et physiologiques. Cette construction micro-tumorale issue de l’ingénierie tissulaire intègre un réseau vasculaire perfusé vivant qui soutient la masse tumorale en croissance, tout comme les vaisseaux nouvellement formés le font in vivo. Il est important de noter que les médicaments et les cellules immunitaires doivent traverser la couche endothéliale pour atteindre la tumeur, modélisant in vivo les barrières physiologiques à l’administration et à l’efficacité thérapeutiques. Étant donné que la plate-forme VMT est optiquement transparente, l’imagerie haute résolution de processus dynamiques tels que l’extravasation des cellules immunitaires et les métastases peut être obtenue grâce à la visualisation directe des cellules marquées par fluorescence dans le tissu. De plus, le VMT conserve l’hétérogénéité tumorale in vivo , les signatures d’expression génique et les réponses médicamenteuses. Pratiquement n’importe quel type de tumeur peut être adapté à la plate-forme, et les cellules primaires de tissus chirurgicaux frais se développent et répondent au traitement médicamenteux dans le VMT, ouvrant la voie à une médecine véritablement personnalisée. Ici, les méthodes d’établissement de la VMT et de son utilisation pour la recherche en oncologie sont décrites. Cette approche novatrice ouvre de nouvelles possibilités pour l’étude des tumeurs et des réponses aux médicaments, offrant aux chercheurs un outil puissant pour faire avancer la recherche sur le cancer.

Introduction

Le cancer reste un problème de santé majeur dans le monde et est la deuxième cause de décès aux États-Unis. Pour la seule année 2023, le National Center for Health Statistics prévoit plus de 1,9 million de nouveaux cas de cancer et plus de 600 000 décès par cancer aux États-Unis¹, soulignant le besoin urgent d’approches thérapeutiques efficaces. Cependant, à l’heure actuelle, seulement 5,1 % des traitements anticancéreux entrant dans les essais cliniques obtiennent finalement l’approbation de la FDA. L’échec des candidats prometteurs à progresser avec succès dans les essais cliniques peut être en partie attribué à l’utilisation de systèmes modè....

Protocole

1. Conception et fabrication

1. Conception de l’appareil
   1. Pour la fabrication d’un dispositif microfluidique, créer un moule SU-8 à l’aide d’une couche de 200 μm de SU-8 enrobée par centrifugation sur une plaquette de Si-1 (nettoyée au RCA-1 et traitée au fluorure d’hydrogène (HF) à 2 %), suivie d’une étape de photolithographie à masque unique comme décrit précédemment ^8,9.
   2. Coulez une réplique en polydiméthylsiloxane (PDMS) de 4 mm d’épaisseur à partir du moule SU-8 pour générer un moule en polyuréthane durable pour les étapes de fabrication en aval. Diverses itérations....

Discussion

Presque tous les tissus du corps reçoivent des nutriments et de l’oxygène par le biais du système vasculaire, ce qui en fait un élément essentiel pour la modélisation réaliste des maladies et le dépistage des médicaments in vitro. De plus, plusieurs tumeurs malignes et états pathologiques sont définis par un dysfonctionnement de l’endothélium vasculaire et une hyperperméabilité³. Notamment, dans le cancer, la vascularisation associée à la tumeur est souvent mal perfus?.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabrication
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95%	Sigma-Aldrich	175617-100G
Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates	Greiner Bio-One	655096
Methanol ≥99.8% ACS	VWR Chemicals BDH	BDH1135-1LP
MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter,	Integra Miltex	33-31AA-P/25
PDMS membrane	PAX Industries	HT-6240
Plasma Cleaner PDC-001	Harrick Plasma	N/A
Smooth-Cast 385	Smooth-On	N/A
SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator	Bel-Art	F42400-4031
Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate	VWR	82050-827
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow	4019862
Cell culture/Loading
BioTek Lionheart FX Automated Microscope	Agilent	CYT5MFAW
CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells	StemBioSys	N/A
Collagen I, rat tail	Enzo Life Sciences
Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4)	Sigma-Aldrich	C5138
Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium	Corning	21-021-CV
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	10013CV
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fibrinogen from bovine plasma	Neta Scientific	SIAL-341573
Fibronectin human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa)	Sigma-Aldrich	FD70S-1G
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Hyaluronidase from sheep testes (type 4)	Sigma-Aldrich	H6254
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017015
Leica TCS SP8	Leica	N/A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts	Lonza	CC-2512
Nikon Eclipse Ti	Nikon	N/A
Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	15735-90-1L
PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells	Lonza	CC-2702
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Avantor Seradigm	97068-091
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144
Quick-RNA Microprep Kit	Zymo Research	R1051
Thrombin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	T4648
Triton X-100 (Electrophoresis),	Fisher BioReagents	BP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Gibco	12605028
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Vasculife	Lifeline Cell Technology	LL-0003