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  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole de prédiction de modélisation de l’homologie d’anticorps est suivi d’un amarrage anticorps-récepteur Pyrx et d’une simulation de dynamique moléculaire. Ces trois méthodes principales sont utilisées pour visualiser les zones de liaison anticorps-récepteur précises et la stabilité de liaison de la structure finale.

Résumé

Les anticorps à fragment variable à chaîne unique (scFv) étaient auparavant constitués de chaînes légères et lourdes variables reliées par un linker (Gly4-Ser) 3. L’éditeur de liens a été créé à l’aide d’un logiciel de modélisation moléculaire en tant que structure de boucle. Ici, nous présentons un protocole d’analysein silico d’un anticorps scFv complet qui interagit avec le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR). La modélisation par homologie, avec Pyrx de l’amarrage protéine-protéine et la simulation de la dynamique moléculaire de l’anticorps scFv en interaction et de l’EGFR Tout d’abord, les auteurs ont utilisé un programme de modélisation de la structure des protéines et Python pour la modélisation de l’homologie, et la structure scFv de l’anticorps a été modélisée pour l’homologie. Les chercheurs ont téléchargé le logiciel Pyrx comme plate-forme dans l’étude d’amarrage. La simulation de dynamique moléculaire a été exécutée à l’aide d’un logiciel de modélisation. Les résultats montrent que lorsque la simulation de DM a été soumise à une minimisation de l’énergie, le modèle protéique avait l’énergie de liaison la plus faible (-5,4 kcal/M). De plus, la simulation MD dans cette étude a montré que l’anticorps EGFR-scFv arrimé était stable pendant 20 à 75 ns lorsque le mouvement de la structure augmentait brusquement à 7,2 Å. En conclusion, une analyse in silicoa été effectuée, et les simulations d’amarrage moléculaire et de dynamique moléculaire de l’anticorps scFv ont prouvé l’efficacité du médicament immunothérapeutique scFv conçu en tant que traitement médicamenteux spécifique pour l’EGFR.

Introduction

Des changements conformationnels dans la protéine (ligand et récepteur) se produisent toujours en fonction des fonctions basées sur la structure. L’étude des sillons de liaison possibles de la protéine et la prédiction de l’interaction de liaison stable constituent une méthode avancée pour préparer des médicaments destinés à une meilleure utilisation dans le corps humain. La modélisation par homologie, suivie d’un amarrage et d’une simulation de dynamique moléculaire, est une méthode simple pour prédire avec précision les interactions stables de liaison entre les résidus de récepteurs et les anticorps construits qui sont utilisés comme médecine personnalisée spécifique 1,2. La structure du modèle prédite peut montrer des changements conformationnels et des réarrangements dans les sites de liaison ligand-récepteur, en particulier à l’interface anticorps-récepteur. Les raisons de ces changements sont nombreuses, telles que la rotation des chaînes latérales, la transformation structurelle globale ou des modifications plus complexes. La principale raison de la modélisation par homologie est de distinguer la structure tertiaire d’une protéine de sa structure primaire 2,3.

Un récepteur tyrosine kinase appelé récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) joue de nombreux rôles biologiques dans les cellules cancéreuses, notamment l’apoptose 4,5, la différenciation 6,7, la progression du cycle cellulaire 8,9, le développement 9,10 et la transcription11. L’EGFR est l’une des cibles thérapeutiques bien connues du cancer du sein12. La surexpression de l’activité régulière des kinases telles que l’EGFR conduit généralement à la progression des cellules cancéreuses, qui peuvent être réprimées par de nombreux types d’inhibiteurs du cancer13. Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) a été utilisé comme récepteur pour la variable de fragment de chaîne unique spécialement conçue pour agir contre ce récepteur. Sa structure prédite a été utilisée pour tester l’activité de liaison de l’anticorps.

Dans cet article, la structure de l’anticorps scFv a été modélisée à l’aide d’un logiciel de modélisation avec un script Python et la méthode de modélisation par homologie14,15. Un modèle d’homologie peut être construit à partir des séquences de protéines et d’acides aminés des récepteurs et des ligands16,17. De plus, des technologies bioinformatiques avancées, telles que l’amarrage moléculaire, ont été utilisées pour prédire comment les ligands de petites molécules se lient au bon site de liaison cible. L’amarrage équilibrerait le développement de nouveaux médicaments destinés à de multiples maladies. Le comportement de liaison est pris en compte 5,18.

De plus, l’amarrage moléculaire est une technique essentielle pour faciliter et accélérer le développement de la liaison ligand-récepteur. L’amarrage moléculaire permet aux scientifiques de cribler virtuellement une bibliothèque de ligands contre une protéine cible et de prédire les conformations et les affinités de liaison des ligands à la protéine réceptrice cible. La simulation dynamique moléculaire (MNS) démontre comment les résidus se déplacent dans l’espace, simule les mouvements des anticorps vers leurs récepteurs et éclaire enfin les efforts de conception d’anticorps. Cette étude est une nouvelle prédiction des dimensions de la boîte de grille qui a décidé comment l’anticorps scFv se lie à l’EGFR et la détection de l’énergie et du temps de cette liaison dans la simulation MD.

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Protocole

1. Prédictions de la structure secondaire d’une protéine à variation de fragment de chaîne unique (scFv)

  1. Construisez la structure 3D de la protéine scFv (single-chain fragment variable) à l’aide de la banque de données de protéines BLAST (PDB), de la numérotation KABAT et du logiciel de modélisation. Le scFv se compose d’un linker (Gly4-Ser) qui relie une chaîne lourde variable (VH) et une chaîne légère variable (VL).
  2. Utilisez le logiciel de modélisation moléculaire pour construire l’éditeur de liens en tant que structure de boucle et effectuez toutes ces méthodes comme décrit dans les études précédentes 2,19,20.

2. Sélection de modèles et prédiction de la structure 3D scFv et EGFR et modélisation d’homologie

  1. Choisissez le modèle 1ivo pour les structures EGFR (en fonction de sa haute résolution). Téléchargez le fichier 1ivo.pdb à partir du site Web pdb, comme illustré à la figure 1B.
  2. Préparez le fichier d’entrée 1ivo.pdb comme décrit ci-dessous.
    1. Dans le fichier 1ivo.pdb, supprimez tous les ligands externes en ouvrant le site Web pdb.org et en sélectionnant le 1ivo. Structure, et en cherchant le nom des ligands sous le titre de petite molécule sur la page de structure 1ivo du site web de pdb.
    2. Trouvez le nom du ligand NAG. Ouvrez le fichier 1ivo.pdb téléchargé sur le site Web de pdb et recherchez le résidu de terminaison (TER).
    3. Supprimer les résidus des ligands externes dans la structure 1ivo, en commençant par le résidu après TER. et avant la fin du résidu. Enregistrez le fichier 1ivo.pdb sur le système.
  3. Préparez le fichier 1ivo.pdb enregistré comme décrit ci-dessous.
    1. Téléchargez le logiciel d’ancrage Autodock (autodock.scripps.edu) à partir de la zone de sélection de fenêtre. Cliquez sur Ouvrir le fichier 1ivo.pdb.
    2. Utilisez la commande Modifier pour choisir Ajouter de l’hydrogène > Ajouter, puis sélectionnez Polaire uniquement, puis appuyez sur OK.
    3. Utilisez la commande Modifier pour ajouter des frais de Kollman (Figure supplémentaire 1). Utilisez la commande Modifier pour supprimer de l’eau. Enregistrez le fichier 1ivo.pdb sur le PC.
  4. Minimisez l’énergie de la structure 1ivo.pdb comme décrit ci-dessous.
    1. Télécharger SPDBV. logiciel de http://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html. Ouvrez le fichier 1ivo.pdb.
    2. Sélectionnez tout. Sélectionnez la commande Perf > Energy minimization > Ok (Figure supplémentaire 2). Enregistrez le fichier 1ivo sur le PC.
  5. Préparez le modèle scFv complet à l’aide de la modélisation d’homologie comme décrit ci-dessous.
    1. Téléchargez le logiciel de modélisation17 et le shell du script Python 3.7.9 à partir de Window- 64. Conservez les fichiers logiciels téléchargés dans le lecteur D.
  6. Préparez les fichiers d’entrée comme décrit ci-dessous.
    1. Chargez le fichier scFv Pdb au format fasta à partir du site Web NCBI et renommez le fichier TARGET.ali. tel qu’il est décrit dans le Fichier de codage supplémentaire 1. Choisissez le modèle à l’aide de la section Blast de NCBI, collez le fichier séquencé, sélectionnez au format pdb 7det.pdb comme décrit dans Fichier de codage supplémentaire 2, puis soumettez-le. Ensuite, utilisez le site Web pdb.org pour obtenir le fichier modèle.
    2. Préparez le troisième fichier d’entrée en tant que align2d.py (Python) comme décrit dans le fichier de codage supplémentaire 3, qui s’ouvre comme illustré à la figure supplémentaire 3A. Appuyez sur l’option Afficher plus, puis accédez à Modifier avec IDLE > Modifier avec EDLE (64 bits). Exécutez à l’aide de la commande run module 5 dans le align2d.py pour obtenir deux fichiers de sortie : Tar- 7det.ali et Tar- 7det.pap.
  7. Effectuez les trois étapes précédentes pour utiliser la commande dans le dernier fichier d’entrée.
  8. Ajoutez un nouveau fichier d’entrée model-single.py (commande python file) comme indiqué dans le fichier de codage supplémentaire 4 et comme décrit ci-dessous.
    1. Appuyez sur l’option Afficher plus, puis accédez à Modifier avec IDLE > Modifier avec EDLE3.7 (64 bits). Exécutez à l’aide de la commande (run module 5) comme illustré à la figure supplémentaire 3B.
      REMARQUE : Les fichiers de sortie résultants sont les six fichiers des modèles d’homologie illustrés à la figure supplémentaire 3C.

3. Prédiction et évaluation de la structure secondaire du récepteur

  1. Détectez la correction et la précision des modèles d’homologie comme décrit ci-dessous.
    1. Créez le tracé de Ramachandran pour les modèles scFv et EGFR en téléchargeant l’outil de visualisation à partir de https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download.
    2. Ouvrez le fichier, puis cliquez avec le bouton droit de la souris et sélectionnez la séquence d’affichage (Figure supplémentaire 4). Copiez la séquence et collez-la dans la base de données Pictorial des structures 3D (pdbsum) www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/.
    3. Sélectionnez Rechercher par séquence, collez la copie de la séquence, puis soumettez-la. Créez le tracé comme illustré à la figure 1B,D.

4. Amarrage protéine-protéine

  1. Téléchargez le logiciel de l’outil de dépistage virtuel.
  2. Allez dans Fichier> lisez Molécules > chargez 1ivo.pdb. Faites un clic droit sur la protéine dans le panneau d’amarrage automatique pour créer une macromolécule. Faites un clic droit à nouveau pour créer un ligand (Figure supplémentaire 5).
  3. Cliquez dans le panneau d’ancrage automatique pour sélectionner protéine , puis ligand.
  4. Ouvrez la liste des protéines. Ensuite, dans la liste, sélectionnez protéine scFv.
  5. Allez à Basculer les sphères de sélection. Ajustez la boîte de grille au centre du récepteur. Cliquez sur Suivant lorsque le bouton rond rose apparaît.
  6. Pour préparer les fichiers pdbqt pour les structures d’anticorps scFv et d’EGFR (1ivo), procédez comme suit.
    1. Allez dans Fichiers de programme > de lecteur C (86) > Utilisateurs, puis choisissez le fichier pyrx qui contient les macromolécules et les fichiers de sortie de protéines qui ont été enregistrés en tant que fichier pdbqt.
    2. Ensuite, enregistrez le fichier pdbqt de l’anticorps scFv (single-chain fragment variable).
  7. Télécharger le logiciel PyMOL chez PyMOL | pymol.org. Utilisez le logiciel PyMOL pour montrer les configurations EGFR du récepteur de l’anticorps scFv.
    1. Allez dans le fichier et ouvrez C :\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein. Préparez les configurations d’amarrage de l’anticorps scFvantibody interagissant avec le récepteur de la figure 2A , comme décrit ci-dessous.
      1. Utilisez l’option d’affichage pour afficher le fichier du récepteur (1ivo) sous forme de résidus de séquence sur fond blanc illustré à la figure supplémentaire 6.
      2. Affichez le fichier de configuration de l’ancrage avec une résolution plus élevée pour voir la couleur du ligand en vert et rouge des résidus. Affichez la surface rigide du récepteur (1ivo) en jaune.
  8. Préparez les configurations d’amarrage du scFvantibody interagissant avec le récepteur de la Figure 2B, comme décrit ci-dessous.
    1. Téléchargez le logiciel d’ancrage à partir de la zone de sélection de la fenêtre. Utilisez l’ancrage automatique pour afficher les configurations et les conformations de l’EGFR du récepteur de l’anticorps scFv.
      1. Dans l’ancrage automatique, choisissez l’option Analyser, puis ouvrez le résultat de l’ancrage automatique Vina. Allez dans Fichier et ouvrez C :\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein.
      2. Sélectionnez le fichier pdb du récepteur protéique, puis sélectionnez la zone de configuration du ligand (structure de l’anticorps scFv). Connectez la surface rigide du récepteur avec la configuration de la structure amarrée et cachez le reste du récepteur. Cachez les résidus éloignés du récepteur des résidus connectés au ligand, comme le montre la figure 2B.
    2. Le complexe protéine-protéine a ensuite été considéré comme prêt à effectuer une simulation de DM.

5. Simulation de dynamique moléculaire (simulation MD) du complexe d’amarrage de l’anticorps EGFR-scFv

  1. Téléchargez le logiciel de simulation MD et utilisez-le comme suit.
    1. Préparez le fichier pdb EGFR (1ivo) à l’aide de l’assistant de réparation, comme dans la figure supplémentaire 7A. Exécutez la section de prétraitement pour affiner le fichier. Envoyez le fichier affiné à définir dans le constructeur du système.
    2. Chargez le logiciel de simulation de dynamique moléculaire à partir du répertoire de travail. Additionnez les ions et mettez à niveau le fichier affiné pour atteindre 20 Å pour soumettre le travail (tableau 1), également illustré à la figure supplémentaire 7B.
    3. Chargez la pdb EGFR (1ivo) à partir du fichier importé, puis choisissez un pas de temps de 100 ns pour l’exécuter (Figure supplémentaire 7C).
  2. Lancez l’analyse de la simulation une fois la MDsimulation terminée comme décrit ci-dessous.
    1. Créez un dossier de tâches et enregistrez-le dans le fichier cms. Chargez le fichier cms pour effectuer cette étape dans la simulation MD.
    2. Créez un répertoire de travail pour les dossiers de projet et indiquez les valeurs énergétiques. Utilisez S.I.D. pdf pour signaler la simulation, comme illustré à la figure 3A, et le diagramme d’interaction et la liaison H, comme illustré à la figure 3B.
    3. Chargez le fichier pdf de cms en naviguant à partir du dossier et utilisez TIP3P comme modèle pour la minimisation du volume de fichiers.
    4. Créez le fichier de solvatation pour effectuer l’étape illustrée à la figure supplémentaire 7D. Enregistrez le fichier pdf via le logiciel et analysez les données, ce qui donne les figures 4, 5 et 6.
  3. Générez une configuration de finalisation MDsimulation en créant le fichier de résolution. Trouvez les résultats dans la boîte de délimitation, comme illustré à la figure 7.

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Résultats

À l’aide de la technologie d’affichage des phages, le gène scFv anti-EGFR a été créé à partir de la lignée d’hybridome de cellules B de souris C3A820,21. Les modèles de structure à variation de fragment de chaîne unique (scFv) des structures VH et VL ont été construits séparément, selon Chua et al.22. Par la suite, les modèles ont été visibles sous forme de rubans fabriqués à l’...

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Discussion

L’EGFR est le principal récepteur cible du cancer du sein. La surexpression de l’EGFR augmente les cas de cancer du sein dans le monde. Pendant ce temps, des anticorps spécifiques tels que les variables de fragment de chaîne unique sont des anticorps qui se déplacent facilement via la circulation sanguine et ont un taux de clairance rapide dans le corps. Les anticorps sont une solution judicieuse et un médicament d’immunothérapie efficace37. Par consé...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Aucun.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Autodock softwareCenter for Computational structural Biology AutoDock (scripps.edu)
Desmond Maestro 19.4 software Schrodingerwww.schrodinger.com 
Download Discovery Studio 2021  Dassault Systems https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download.
Modeler Version 9.24[17] University of Californiahttps://salilab.org/modeller/9.24/release.html
Pictorial database of 3D structures (pdbsum)EMBL-EBI www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/
PyMOL software SchrodingerPyMOL | pymol.org
Pyrx software Sourceforge Download PyRx - Virtual Screening Tool (sourceforge.net)
Python script 3.7.9 shell from the window (64)PythonPython Release Python 3.7.9 | Python.org
SPDBV software Expasyhttp://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html

Références

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