Visualisation in vivo de l’activité spontanée dans le cortex sensoriel d’une souris néonatale à une résolution d’un seul neurone

Résumé

Les zones sensorielles primaires du néocortex présentent des activités spontanées uniques au cours du développement. Cet article décrit comment visualiser les activités neuronales individuelles et les zones sensorielles primaires pour analyser les activités synchrones spécifiques à une zone chez des souris néonatales in vivo.

Résumé

Le cerveau des mammifères subit des changements de développement dynamiques au niveau cellulaire et des circuits tout au long des périodes prénatales et postnatales. Suite à la découverte de nombreux gènes contribuant à ces changements de développement, on sait maintenant que l’activité neuronale module également considérablement ces processus. Dans le cortex cérébral en développement, les neurones présentent des modèles d’activité synchronisés qui sont spécialisés dans chaque zone sensorielle primaire. Ces modèles diffèrent nettement de ceux observés dans le cortex mature, mettant l’accent sur leur rôle dans la régulation des processus de développement spécifiques à une zone. Les déficiences de l’activité neuronale au cours du développement peuvent entraîner diverses maladies cérébrales. Ces résultats soulignent la nécessité d’examiner les mécanismes régulateurs sous-jacents aux modèles d’activité dans le développement neuronal. Cet article résume une série de protocoles permettant de visualiser les zones sensorielles primaires et l’activité neuronale chez les souris néonatales, d’imager l’activité des neurones individuels dans les sous-champs corticaux à l’aide de la microscopie à deux photons in vivo, et d’analyser les corrélations d’activité liées aux sous-champs. Nous montrons des résultats représentatifs d’une activité synchrone de type patchwork dans des barils individuels du cortex somatosensoriel. Nous discutons également de diverses applications potentielles et de certaines limites de ce protocole.

Introduction

Le cortex cérébral contient plusieurs zones sensorielles avec des fonctions distinctes. Les zones reçoivent des informations provenant de leurs organes sensoriels correspondants, principalement véhiculées par la moelle épinière ou le tronc cérébral et relayées par le thalamus ^1,2. Notamment, les neurones de chaque aire sensorielle primaire présentent une activité synchronisée unique au cours des premiers stades de développement, qui proviennent également des organes sensoriels ou des centres nerveux inférieurs, mais diffèrent essentiellement des activités observées dans le cor....

Protocole

Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives pour l’expérimentation animale de l’Université de Kumamoto et de l’Institut national de génétique et approuvées par les comités d’expérimentation animale.

1. Électroporation in utero (IUE)

1. Accouplez des souris TCA-RFP mâles de fond ICR avec des souris ICR femelles de type sauvage. Observez le plug vaginal pour vérifier s’il y a un accouplement tôt le matin du lendemain. Observez l’abdomen pour vérifier s’il y a une grossesse 2 semaines plus tard.
2. Préparez une solution plasmidique contenant 5 ng/μL....

Discussion

Étant donné que les activités spontanées émergent de l’organe sensoriel ou du système nerveux inférieur et se déplacent vers l’aire sensorielle primaire par une voie équivalente à celle d’un système nerveux mature³, il est crucial de définir l’aire sensorielle primaire et l’emplacement des neurones imagés dans la zone. Dans ce protocole, nous avons répondu à cette exigence en utilisant des souris transgéniques qui visualisent les axones t.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
20× objective lens (water immersion)
250 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System	Corning	431096
4%-paraformaldehyde phosphate buffer solution (4% PFA)	Nacalai	09154-85
Acrylic resin (UNIFAST II)	GC	N/A
Agarose	Sigma	A9793
Aspirator tube assembly	Drummond	2-040-000
CaCl2•2H2O	Nacalai	06731-05
Electroporator	BEX	GEB14
Eye drop (Scopisol)	Senju Pharmaceutical	N/A
Fluorescence stereo microscope	Leica	M165FC
Glucose	Nacalai	16806-25
Heating pad	Muromachi Kikai	FHC-HPS
HEPES	Gibco	15630-080
Isoflurane	Pfizer	N/A
KCl	Nacalai	28514-75
MgSO4•7H2O	Wako	131-00405
Micropipette puller	Narishige	PC-100
Multiphoton laser	Spectra-Physics	Mai Tai eHP DeepSee
Multiphoton microscope	Zeiss	LSM 7MP
NaCl	Nacalai	31320-05
Non-woven fabric (Kimwipe)	Kimberly Clark	S-200
Phosphate buffered saline (PBS)	Nacalai	27575-31
Plasmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE	Addgene	pK175
Plasmid: TRE-nCre	Addgene	pK031
Precision calibrated micropipets	Drummond	2-000-050
Razor blade	Feather	FA-10
Rimadyl (50 mg/mL Carprofen)	Zoetis JP	N/A
Round cover glass, 3-mm-diameter	Matsunami	CS01078
Saline	Otsuka	035175315
Sodium pentobarbital	Nacalai	26427-72
Stage for imaging living pup (two single-axis translation stage for XY positioning, two-axis goniometer, base plate, adjustable pillar for z positioning)	ThorLabs	LT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFP mouse	N/A	N/A	Mizuno et al., 2018a
Tissue adhesive (Vetbond)	3M	1469SB
Titanium bar	Endo Scientific Instrument	N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Titanium bar fixing plate		N/A	Custom made (Mizuno et al., 2018b)
Trypan blue	Sigma	T8154
Tweezers with platinum plate electrode, 5 mm diameter	BEX	CUY650P5
Wild-type ICR mouse	Nihon SLC	Slc:ICR