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  • Déclarations de divulgation
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Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour induire l’hypertension de type H et évaluons les effets antihypertenseurs de la décoction Huotan Jiedu Tongluo (HTJDTLD) administrée par voie intragastrique. Chez les rats atteints d’hypertension de type H, HTJDTLD a eu des effets antihypertenseurs efficaces, peut-être associés à l’inhibition de l’activation de la voie d’apoptose induite par le stress du réticulum endoplasmique (RE).

Résumé

L’hypertension de type H, qui est une forme spécifique d’hypertension caractérisée par des taux élevés d’homocystéine plasmatique (Hcy), est devenue un défi majeur de santé publique dans le monde entier. Cette étude a examiné les effets hypotenseurs et les mécanismes sous-jacents de la décoction de Huotan Jiedu Tongluo (HTJDTLD), une formule de médecine traditionnelle chinoise très efficace couramment utilisée pour traiter la sténose vasculaire. La méthionine a été utilisée pour induire l’hypertension de type H chez les rats, et le HTJDTLD a été administré par voie intragastrique. Ensuite, les pressions artérielles systolique et diastolique de l’artère caudale de rats ont été mesurées par manométrie caudale non invasive chez le rat. L’évaluation histologique de l’aorte a été réalisée par coloration à l’hématoxyline-éosine (HE). Le test immuno-enzymatique (ELISA) a été utilisé pour mesurer les niveaux de Hcy, et la réaction en chaîne par polymérase quantitative de la transcriptase inverse (qRT-PCR) et le western blot ont été utilisés pour déterminer les niveaux d’ARNm et de protéines de la protéine régulatrice du glucose 78 (GRP78), du facteur associé au récepteur du facteur de nécrose tumorale (TNF) (TRAF2), des kinases N-terminales c-Jun (JNK) et de la caspase-3. Les résultats ont montré que HTJDTLD abaissait significativement la pression artérielle, atténuait les lésions histopathologiques et diminuait les taux de Hcy après un traitement à la méthionine. De plus, HTJDTLD a inhibé de manière significative l’expression génique et protéique de GRP78, JNK, TRAF2 et caspase 3, qui sont principalement impliqués dans la voie d’apoptose induite par le stress du réticulum endoplasmique (RE). Dans l’ensemble, les résultats ont indiqué que HTJDTLD avait des effets antihypertenseurs efficaces chez les rats atteints d’hypertension de type H et ont révélé les mécanismes antihypertenseurs associés à l’inhibition de l’activation de la voie d’apoptose induite par le stress du RE.

Introduction

L’hypertension, un facteur de risque majeur de crise cardiaque, d’accident vasculaire cérébral et d’insuffisance rénale, est devenue un défi de santé publique important qui touche 1 milliard de personnes dans le monde1. L’homocystéine (Hcy), un acide aminé contenant le groupe thiol, est un intermédiaire métabolique vital du métabolisme de la méthionine. L’hypertension avec des taux plasmatiques élevés de Hcy est définie comme une hypertension de type H, qui pourrait être un facteur de risque important pour l’apparition et la récurrence de maladies cardio-cérébrovasculaires telles que les accidents vasculaires cérébraux 2,3. Des études récentes ont rapporté que la co-résidence de l’hypertension de type H pourrait aggraver les effets secondaires des maladies cardiovasculaires et cérébrovasculaires4. Notamment, 75 % des patients en Chine souffrant d’hypertension de type H souffrent d’hypertension primaire, ce qui affecte gravement la qualité de vie5. À l’heure actuelle, le traitement de l’hypertension de type H comprend principalement la médecine occidentale. Cependant, il peut entraîner certains effets indésirables et une mauvaise observance et ne peut plus répondre aux besoins de prise en charge globale de l’hypertension de type H.

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) est une ressource unique avec une histoire de plus de 2 000 ans en Chine. En raison du besoin non satisfait de contrôle de l’hypertension dans la médecine occidentale, les cliniciens ont commencé à considérer le rôle potentiel de la MTC dans la prévention et le traitement de l’hypertension de type H6. La décoction de Huotan Jiedu Tongluo (HTJDTLD) est une formule de médecine traditionnelle chinoise formulée par le professeur Yue Deng, s’appuyant sur sa vaste expertise clinique7. Au cours de plus de 20 ans d’application clinique, HTJDTLD a démontré une efficacité remarquable dans le traitement des maladies cardiovasculaires et cérébrovasculaires1. Cependant, il n’a pas été précisé si HTJDTLD a des effets thérapeutiques dans l’hypertension de type H. Par conséquent, nous avons cherché à explorer les effets antihypertenseurs et les mécanismes spécifiques de HTJDTLD chez les rats atteints d’hypertension de type H et à identifier des médicaments thérapeutiques potentiels pour le traitement de l’hypertension de type H.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de médecine chinoise de Changchun. Les matériaux sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Animaux et traitement

  1. Divisez au hasard un total de 50 rats adultes présentant une hypertension spontanée (SHR) (mâles, âgés de 50 jours) en cinq groupes, y compris les groupes témoin (CON), méthionine (MET), MET + HTJDTLD + Maléate d’énalapril (EM), MET + EM et MET + HTJDTLD.
    REMARQUE : Les rats expérimentaux ont été logés dans un environnement contrôlé conçu pour assurer leur confort et leur bien-être. L’installation comportait des pièces à température contrôlée réglées à une température constante de 22 °C, avec une humidité relative de 40 à 60 %. Les cages d’habitation étaient en polycarbonate transparent, offrant suffisamment d’espace pour que chaque rat puisse se déplacer librement. Le programme d’éclairage a suivi un cycle lumière/obscurité de 12 heures, simulant les conditions naturelles de la lumière du jour. Les rats ont reçu suffisamment de nourriture et d’eau.
  2. Donnez aux rats le régime suivant pendant 28 jours.
    1. Donnez aux rats du groupe MET un régime à 3% de méthionine pendant 28 jours pour induire une hypertension de type H.
    2. Administrer les rats du groupe MET + HTJDTLD + EM par voie intragastrique avec HTJDTLD (1,633 g/mL) et EM (0,2 mg/mL) à la dose de 1 mL/kg lorsque les rats en plus du régime à 3% de méthionine.
    3. Administrer les rats des groupes MET + EM et MET + HTJDTLD avec HTJDTLD ou EM par gavage, respectivement, en plus du régime à 3% de méthionine.
      REMARQUE : Le HTJDTLD se compose de Fructus Trichosanthis (20 g), Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae (15 g), Lonicerae japonicae flos (30 g), Radix et Rhizoma Nardostachyos (15 g), Radix Angelicae sinensis (15 g), Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (10 g), Hirudo (5 g), Radix et Rhizoma Rhodiolae crenulatae (15 g) et Radix Scrophulariae (15 g), et a été décocté comme indiqué précédemment7. Les EM dissous dans de l’eau purifiée (0,2 mg/mL) ont servi de témoin positif.

2. Mesure de la pression artérielle

REMARQUE : Les mesures de la pression artérielle sont effectuées à l’aide d’un sphygmomanomètre non invasif (Table des matériaux).

  1. Après un traitement de 28 jours, faites jeûner les rats de chaque groupe pendant 12 h et mesurez la pression artérielle.
  2. Choisissez un dispositif de contention qui correspond à la taille du rat. Le dispositif de retenue utilisé dans cette étude comprend un treillis de contention cylindrique, un couvercle en toile, un tube thermique et un coussin en mousse stabilisatrice. Placez le rat dans le grillage de contention, placez le treillis de contention dans le tube thermique, puis placez le tube thermique dans le couvercle en toile.
  3. Placez le câble de signal dans une position appropriée sous le couvercle. Placez la queue du rat dans l’espace prévu à cet effet dans le couvercle et fixez-la sur le tampon de forme stabilisateur. Un environnement inoccupé, calme et chaud est préférable pour les mesures. Déplacez les rats sur le site de mesure 20 à 30 minutes à l’avance afin qu’ils puissent s’adapter à l’environnement de mesure.
    REMARQUE : Les étapes 2.2-2.3 peuvent être effectuées plusieurs fois pour stabiliser les rats. Après plusieurs séances d’entraînement, les rats s’y habitueront et pourront se stabiliser très rapidement, ce qui est pratique pour la mesure ultérieure de la pression artérielle.
  4. Connectez le raccord du tuyau d’air, le raccord du signal et le tube de retenue du capteur sous pression. Placez le capteur de pressurisation à l’extrémité de la queue.
  5. Mesurez la pression artérielle. Une onde de pouls apparaît après l’insertion de la queue de rat dans le capteur. Appuyez sur Start/Stop pour démarrer/arrêter la mesure.
    REMARQUE : L’appareil déterminera automatiquement si la queue du rat est insérée dans le capteur. Lorsque la queue du rat n’est pas insérée, le capteur de pressurisation ne commence pas à pressuriser et n’effectue pas la mesure.
  6. Une fois le test de tension artérielle terminé, le menu Résultat s’affiche automatiquement. Vérifiez la valeur moyenne de la mesure, l’écart-type (ET), l’erreur-type (ET) et le coefficient de variation (CV) dans le menu Résultats .
    REMARQUE : La pression artérielle de chaque rat a été mesurée trois fois, avec un intervalle de plus de 2 minutes, et la valeur moyenne a été calculée.
  7. Après avoir mesuré la pression artérielle, euthanasier le rat par injection intrapéritonéale d’un excès de pentobarbital sodique à 2 % (100 mg/kg). Ensuite, à l’aide de ciseaux chirurgicaux et de pinces dentées, disséquez le rat couche par couche, du périnée au cou. Retournez le contenu thoracique et abdominal, naviguez jusqu’à la bifurcation de l’aorte abdominale entre les deux reins et collectez l’aorte jusqu’à une section de l’arc aortique.

3. Coloration à l’hématoxyline-éosine (HE)

  1. Fixer le tissu vasculaire aortique dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 24 h.
  2. Prenez les échantillons vasculaires, déshydratez-les dans de l’alcool dégradé, rendez-les transparents dans du xylène et incrustez-les dans de la paraffine.
  3. Après l’enrobage, faites des tranches continues d’une épaisseur de 3 à 5 mm. Séchez les tranches à 60-70 °C, puis conservez-les à température ambiante (RT).
  4. Daffinez les sections en les immergeant dans du xylène I pendant 30 min, du xylène II pendant 30 min, de l’alcool à 100 % I pendant 10 min, de l’alcool à 100 % II pendant 10 min, de l’alcool à 95 % I pendant 5 min, de l’alcool à 95 % II pendant 5 min, de l’alcool à 80 % pendant 5 min, puis rincez à l’eau distillée.
  5. Teignez les sections avec de l’hématoxyline Harris pendant 5 min et rincez à l’eau du robinet pendant 5 min. Différencier dans de l’alcool à 1 % d’acide chlorhydrique pendant 10 s et rincer abondamment à l’eau du robinet pendant 15 min. Lavez la section à l’eau ammoniacale pendant 5 s et rincez abondamment à l’eau du robinet pendant 15 min.
  6. Effectuez une observation microscopique, colorez à l’éosine pendant 10 min et rincez abondamment à l’eau du robinet pendant 15 min.
  7. Déshydratez les sections en les immergeant dans de l’alcool éthylique à 80 % pendant 10 s, de l’alcool à 95 % I pendant 5 min, de l’alcool à 95 % II pendant 5 min, de l’alcool à 100 % I pendant 10 min, de l’alcool à 100 % II pendant 10 min, du xylène I pendant 10 min et du xylène II pendant 10 min.
  8. Scellez les sections à l’aide de gomme neutre.
  9. Observez les changements histologiques dans les tissus de l’aorte au microscope optique (objectif 100x, grossissement 1000x).

4. Coloration trichrome de Masson

  1. Effectuez un déparaffinage de routine similaire à la coloration HE.
  2. Coloration à l’hématoxyline : Plongez les lames dans une solution d’hématoxyline pendant 10 min, puis rincez immédiatement à l’eau du robinet.
  3. Plongez les lames dans une solution d’acide chlorhydrique à 1 % pendant quelques secondes, puis rincez à l’eau du robinet immédiatement après.
  4. Immergez les lames dans la teinture magenta acide du Lichtenstein pendant 5 min, puis rincez à l’eau.
  5. Immergez les lames dans de l’acide phosphomolybdique à 1 % pendant 5 min.
  6. Immergez les lames dans une coloration au bleu d’aniline à 2 % pendant 5 min et dans une solution de lavage par immersion d’acide acétique glacial à 1 % pendant 1 min. Ensuite, lavez rapidement les lames dans de l’alcool à 95% 3 fois.
  7. Effectuez une déshydratation régulière, une transparence et un scellement neutre de la gomme similaire à la coloration HE.

5. Mesure Hcy par ELISA

  1. Anesthésier les rats par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 2 % (45 mg/kg) et confirmer la profondeur de l’anesthésie par un pincement de l’orteil. Tenez le rat et coupez les moustaches pour éviter tout contact lors de la prise de sang. Retirez les globes oculaires du rat à l’aide d’une pince incurvée et recueillez le sang dans les tubes de microcentrifugation stériles préparés. Et ensuite, euthanasiez le rat avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique à 2% (100 mg / kg).
  2. Laissez le sang coaguler naturellement pendant 10 à 20 minutes à l’heure de l’art, puis centrifugez le sang (626-1409 x g) pendant environ 20 minutes à 2-8 °C.
  3. Récupérez soigneusement le surnageant et conservez-le au réfrigérateur à -80 °C.
  4. Diluez l’étalon dans le tube à essai selon les instructions du kit.
  5. Installez des puits blancs (aucun échantillon ni réactif enzymatique n’est ajouté aux puits de contrôle blancs ; le reste des étapes est le même), des puits standard et des puits d’échantillonnage à tester. Ajoutez 50 μL d’étalons dans la plaque, 40 μL de solution de dilution de l’échantillon dans les puits d’échantillon, puis 10 μL de sérum (la dilution finale de l’échantillon est de 5 fois).
    REMARQUE : Ajouter l’échantillon au fond des puits de la plaque ; Essayez de ne pas toucher les parois des puits et secouez doucement pour mélanger.
  6. Scellez la plaque avec un film d’étanchéité et incubez à 37 °C pendant 30 min.
  7. Diluez la solution de lavage concentrée 30 fois avec de l’eau distillée et préparez-vous à l’utilisation.
  8. Retirez soigneusement le film d’étanchéité, jetez le liquide et secouez-le pour éliminer tout le liquide. Remplissez chaque puits de solution de lavage, laissez-le pendant 30 s et jetez-le. Répétez cette opération 5 fois et séchez-la en tapotant.
  9. Ajouter 50 μL de réactif enzymatique dans chaque puits, à l’exception des puits blancs.
  10. Utilisez un film d’étanchéité pour sceller la plaque, puis incubez à 37 °C pendant 30 min.
  11. Répétez l’étape 5.8.
  12. Ajoutez 50 μL de révélateur de couleur A dans chaque puits, puis ajoutez 50 μL de révélateur de couleur B et secouez doucement pour bien mélanger. Incuber à 37 °C pendant 10 min sous une faible lumière.
  13. Ajouter 50 μL de la solution d’arrêt dans chaque puits pour terminer la réaction (la couleur bleue deviendra jaune).
  14. Mettez à zéro la réaction avec des puits à blanc et mesurez l’absorbance (valeur OD) de chaque puits séquentiellement à 450 nm.
    REMARQUE : La mesure doit être effectuée dans les 15 minutes suivant l’ajout de la solution d’arrêt.

6. Extraction d’ARN et RT-PCR quantitative

  1. Extraire l’ARN total.
    1. Coupez rapidement le tissu aortique frais à la taille appropriée (30-50 mg/pièce) et broyez-le soigneusement dans de l’azote liquide. Ajouter 1 ml de réactif Trizol, bien mélanger et incuber sur de la glace pendant 10 minutes pour lyser le tissu.
    2. Centrifugeuse à 2250 x g pendant 10 min à 4 °C. Transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation sans granulés.
    3. Ajouter 200 μL de chloroforme, agiter vigoureusement pendant 15 s et incuber à RT pendant 5 min.
    4. Centrifugeuse à 2250 x g pendant 15 min à 4 °C. Le mélange sera divisé en trois couches : la phase organique inférieure phénol-chloroforme, la phase intermédiaire et la phase aqueuse supérieure.
    5. Transférez soigneusement la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de microcentrifugation (environ 60% du volume de Trizol). Ne pas aspirer la phase intermédiaire ; Une petite quantité de liquide supérieur peut être laissée.
    6. Ajouter un volume égal d’isopropanol, mélanger délicatement en inversant environ 10 fois, et laisser reposer 10 min à RT.
    7. Centrifugeuse à 2250 x g pendant 10 min à 4 °C. Jeter le surnageant et laver le précipité d’ARN deux fois avec 1 mL d’éthanol à 75 %.
    8. Centrifuger à 2250 x g pendant 5 min à 4 °C, jeter le surnageant et sécher à l’air libre à RT pendant 5 à 10 min.
    9. Dissoudre l’ARN dans 15 à 50 μL d’eau de diéthylpyrocarbonate (DEPC) et vérifier la concentration d’ARN.
  2. Effectuer la transcription inverse et la RT-qPCR (Tableau 1)
    1. Détecter l’expression génique liée au stress du réticulum endoplasmique (ERS) et à l’apoptose par qRT-PCR. Utilisez l’ARN total extrait à l’étape 6.1 et transcrivez-le en ADNc à l’aide du kit de synthèse d’ADNc selon les instructions du fabricant.
    2. Déterminez l’expression des gènes à l’aide d’un système de détection PCR en temps réel avec un mélange maître de PCR SYBR Green dans un volume de réaction de 20 μL.
    3. Analyser quantitativement les données par la méthode 2−ΔΔCTet les exprimer sous la forme d’une différence n fois par rapport à l’expression de la β-actine. Les amorces sont présentées dans le tableau 2.

7. Transfert Western (WB)

  1. Extraire la totalité des protéines tissulaires.
    1. Placez une petite quantité de bloc de tissu dans la partie sphérique de l’homogénéisateur de 1 à 2 ml et coupez le bloc de tissu autant que possible avec des ciseaux propres.
    2. Ajouter 400 μL (w :v = 1:10) du tampon de lyse RIPA et homogénéiser. Ensuite, placez-le sur de la glace. Après quelques minutes, broyez à nouveau et placez sur de la glace. Répétez le processus de broyage plusieurs fois.
    3. Après 30 minutes de lyse, à l’aide d’une pipette, transférez le lysat dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et placez le tube dans une centrifugeuse pré-refroidie à 4 °C. Centrifuger à 2250 x g pendant 10 min et transférer le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 mL.
  2. Quantifiez la protéine.
    1. Diluez les étalons protéiques selon les instructions du kit. Obtenir les gradients d’étalons suivants : 0, 25, 125, 250, 500, 1000, 1500 et 2000 ng/μL.
    2. Prélever 2,5 μL de l’échantillon de protéines et le diluer à 25 μL (10 fois) à l’aide du diluant de l’échantillon.
    3. Prenez une plaque de 96 puits et ajoutez 20 μL d’échantillon de protéine standard (selon le gradient de concentration) et de protéine cible dans les puits, respectivement deux puits pour chaque échantillon de protéine cible.
    4. Préparez la solution de développement (prête à l’emploi) en mélangeant le liquide A et le liquide B dans un rapport de 50:1, et ajoutez 200 μL de solution de développement dans chaque puits.
    5. Placez la plaque à 96 puits avec les échantillons ajoutés dans un incubateur à 37 °C pendant 30 min.
    6. Détecter l’absorbance à 562 nm.
    7. Calculez la concentration de protéines à mesurer.
      1. Prenez la concentration standard en protéines comme coordonnée verticale et l’absorbance à 562 nm comme coordonnée horizontale pour tracer la courbe standard.
      2. Calculez la concentration de la protéine cible à l’aide de la formule obtenue à partir de la courbe standard et de l’absorbance mesurée de la protéine cible.
    8. Ajouter 180 μL de tampon de charge à 20 μL d’échantillon de protéines dans un tube de microcentrifugation. Placez le tube de centrifugation dans un bain métallique et dénaturez-le à 100 °C pendant 10 min. Utilisez la protéine dénaturée WB ou conservez-la à -20 °C.
  3. Effectuez un immunobuvardage.
    1. Configurer le gel d’électrophorèse des protéines.
      1. Nettoyez et séchez au sèche-cheveux la plaque de verre de coulée de gel (1 mm ou 1,5 mm) et fixez-la sur l’appareil de coulée de gel.
      2. Préparez du gel de séparation à 10 % conformément au tableau 3. Ajoutez le gel de séparation configuré entre les plaques de verre. Ajoutez lentement la solution de gel pour éviter la production de bulles d’air. Ensuite, ajoutez une quantité appropriée d’éthanol anhydre pour aplatir la surface liquide du séparateur. Laissez-le à RT pendant 20-30 min jusqu’à ce que le gel soit solidifié.
        REMARQUE : Plus le poids moléculaire est élevé, plus la concentration de colle est faible, selon la nécessité de formuler d’autres concentrations de colle de séparation.
      3. Préparez un gel concentré à 5 % conformément au tableau 3. Après la solidification du gel de séparation, versez la couche supérieure d’éthanol anhydre, remplissez le gel concentré et insérez lentement le peigne de gel qui correspond à la plaque de verre (attention à ne pas avoir de bulles d’air). Laissez-le à RT pendant 20-30 min pour que le gel concentré se solidifie.
    2. Effectuez une électrophorèse.
      1. Pesez 60,5 g de Tris, 375 g de glycine et 20 g de dodécylsulfate de sodium (SDS). Ajouter de l’eau à 2 L, chauffer à 60 °C et remuer pour dissoudre jusqu’à obtenir une solution d’électrophorèse 10x. Que la solution soit chez RT ; Diluez-le à 1x lors de l’utilisation.
      2. Retirez la plaque de verre contenant la colle de l’appareil de coulée de gel, tirez le peigne de colle dans le flux d’eau à une vitesse uniforme et, en même temps, vidangez les bulles d’air dans le trou d’échantillonnage.
      3. Fixez la plaque de verre dans le réservoir d’électrophorèse et ajoutez la solution d’électrophorèse 1x configurée. Assurez-vous que le réservoir intérieur est plein et que le réservoir extérieur est la moitié du réservoir intérieur.
      4. Ajouter la même masse d’échantillon de protéines et 5 μL de marqueur (utilisé pour indiquer la taille des protéines) dans le puits d’ajout d’échantillon.
      5. Faites fonctionner le gel à 60 V pendant 20 min, puis à 100 V pendant 90 min jusqu’à ce que le tampon de chargement descende vers le bas.
    3. Effectuer le transfert membranaire.
      1. Pesez 60 g de Tris et 288 g de glycine, et ajoutez de l’eau à 2 L. Remuez et dissolvez bien la solution pour obtenir 10 fois la solution de transfert membranaire, et réservez à RT. Diluez dans un rapport de 1:2:7 (10 fois la solution transmembranaire : méthanol : eau) pour obtenir 1 fois la solution de travail.
        REMARQUE : La solution transmembranaire doit être préparée à l’avance et refroidie à 4 °C au réfrigérateur.
      2. Faites tremper le PVDF dans du méthanol pendant une période de temps appropriée (0,5 à 1 min) pour activer les groupes chargés positivement sur la membrane et faciliter la liaison avec les protéines chargées négativement.
      3. Prenez le clip de transfert de membrane et fixez-le après avoir placé les composants dans l’ordre (surface noire-éponge-papier filtre-gel d’électrophorèse-membrane PVDF-papier filtre-éponge-surface blanche en séquence).
        REMARQUE : Veillez à éviter les bulles d’air ; Lorsqu’il y a des bulles d’air, utilisez le rouleau pour chasser les bulles d’air.
      4. Placez l’attelle dans le réservoir de transfert de membrane, veillez à suivre le bon placement des électrodes, mettez deux sacs de glace dans le réservoir et remplissez-le de 1x liquide de transfert de membrane. Enfin, placez l’ensemble du réservoir transmembranaire dans de la glace.
      5. Réglez les conditions de transfert de la membrane sur 100 V pendant 1 h.
        REMARQUE : Le temps de transfert de la membrane peut être ajusté en fonction de la taille de la protéine ; Plus le poids moléculaire de la protéine est petit, plus le temps de transfert membranaire est court.
    4. Effectuez un blocage.
      1. Pour les protéines phosphorylées, utilisez 5% de BSA (solvant TBST) comme solution de blocage. Pour les protéines non phosphorylées, utilisez du lait écrémé à 5 % (solvant TBST) pour le blocage.
      2. Versez la solution de blocage dans un plat de taille appropriée. Placez la membrane PVDF dans la parabole et assurez-vous que la membrane PVDF est immergée dans la solution de blocage. Fermer le plat et incuber à RT pendant 1 h.
      3. Retirez la membrane. En fonction de l’affichage du marqueur et de la taille de chaque protéine cible, coupez la membrane à la taille appropriée et étiquetez-la avec des numéros de série.
    5. Incuber l’anticorps
      1. Retirez la solution de blocage et absorbez le liquide résiduel avec du papier filtre. Placez le PVDF coupé correspondant dans les dilutions d’anticorps correspondantes (y compris CPR78 [1:1000], TRAF2 [1:1000], p-JNK [1:1000], caspase [1:1000] et GAPDH [1:1000]) et placez-le sur l’agitateur rotatif à 4 °C pendant la nuit.
      2. Ajouter 1x TBST et rincer à RT trois fois (10 min chacune).
      3. Incuber la membrane PVDF dans les dilutions secondaires des anticorps selon les instructions du fabricant et incuber à RT pendant 1 h.
      4. Rincez la membrane en ajoutant 1x TBST à RT trois fois (10 min chacune).
    6. Développer la membrane PVDF.
      1. Mélangez des volumes égaux de liquide A et de liquide B dans le kit de solution luminescente, secouez bien et préparez-vous à l’utilisation.
      2. Placez la membrane PVDF sur le film alimentaire à étaler, et ajoutez rapidement et uniformément l’agent luminescent préparé sur la membrane rapidement et uniformément. Incuber pendant 3 min à RT en évitant la lumière.
      3. Détectez les bandes protéiques à l’aide de réactifs de détection par transfert Western par chimiluminescence améliorée (ECL).

8. Analyse des données

  1. Exprimer toutes les données sous forme de moyenne ± écart-type. Effectuer une analyse statistique par ANOVA unidirectionnelle à l’aide du logiciel SPSS 20.0. Considérez les différences statistiquement significatives lorsque p < 0,05.

Résultats

Comme le montrent les tableaux 4 et 5, la pression artérielle systolique (TAS) et la pression artérielle diastolique (TAD) étaient significativement plus élevées dans le groupe MET que dans le groupe CON de 1 à 4 semaines. Après le traitement par HTJDTLD, la TAS et la TAD des rats étaient significativement plus faibles que celles du groupe MET. Notamment, l’utilisation combinée de HTJDTLD et d’EM a eu un effet antihypertenseur plus fort que le traitement HTJDTLD seul.

Discussion

L’hypertension est l’un des troubles cardiovasculaires les plus courants qui touche un tiers de la population adulte et augmente le risque d’accident vasculaire cérébral, de maladie coronarienne et d’insuffisance cardiaque et rénale8. L’hypertension de type H est un type particulier d’hypertension qui fait référence à la cooccurrence de l’hypertension primaire et de l’augmentation des taux d’homocystéine et a attiré une large attention au fil des ans9

Déclarations de divulgation

Nous déclarons que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de la province de Jilin (no. YDZJ202301ZYTS189).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCRYeasen,China11149EScDNA synthesis kit 
Anti-beta-actin antibodyBioss, Chinabs-0061R
Anti-caspase-3 antibodyBioss, Chinabs-0081R
Anti-GPR78 antibodyAbcam, USAab108513
Anti-JNK antibodyAbcam, USAab76572
Anti-p-JNK antibodyBioss, Chinabsm-52462R
Anti-rabbit IgG antibodyBioss, Chinabs-0295G-HRP
Anti-TRAF2 antibodyBioss, Chinabs-22372R
Bio-Rad CFX96 Touch system Bio-RadCFX96real-time PCR detection system 
ECL Western Blot SubstratesMerck, MA, USAWBULP-10ML
Enalapril maleate folic acid tabletsYangzijiang Pharmaceutical Company, China20040991
FastStart SYBR Green MasterSigmaFSSGMMRO
Fructus TrichosanthisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
HirudoThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
intelligent noninvasive sphygmomanometer Beijing Softron Biotechnology companyBP-2010A
Lonicerae Japonicae FlosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
MethionineSigma, USAM9500
Radix Angelicae SinensisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma GlycyrrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma NardostachyosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Rhodiolae CrenulataeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Salviae MiltiorrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix ScrophulariaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Rat Hcy ELISA KitsShanghai Meimian Industrial Company, ChinaMM-0293R2
RIPA bufferShanghai Beyotime Biotechnology companyP0013B

Références

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