Cristallisation et collecte in situ de données à température ambiante à l’aide de l’installation de cristallisation de Harwell et de la ligne de faisceau VMXi, source de lumière au diamant

Résumé

Nous présentons un protocole pour la cristallisation des protéines à l’aide de l’installation de cristallisation du complexe de recherche à Harwell et la collecte ultérieure de données cristallographiques aux rayons X in situ à partir de cristaux à l’intérieur des plaques sur la ligne de faisceau VMXi (Versatile Macromolecular Crystallography in situ ) de Diamond. Nous décrivons les exigences en matière d’échantillons, les protocoles de cristallisation et les directives de collecte de données.

Résumé

Les protocoles de cristallisation robotisée des protéines à l’aide de l’installation de cristallisation de Harwell et de collecte de données in situ à température ambiante à partir de plaques de cristallisation à la ligne de lumière VMXi de la source de lumière Diamond sont décrits. Cette approche permet de déterminer facilement des structures cristallines de haute qualité à température ambiante à partir de plusieurs cristaux et fournit un retour d’information très rapide sur les résultats des essais de cristallisation ainsi que la cristallographie en série. La valeur des structures à température ambiante dans la compréhension de la structure des protéines, de la liaison au ligand et de la dynamique est de plus en plus reconnue dans la communauté de la biologie structurale. Ce pipeline est accessible aux utilisateurs du monde entier avec plusieurs modes d’accès disponibles. Les expériences de cristallisation mises en place peuvent être imagées et visualisées à distance avec des cristaux identifiés automatiquement à l’aide d’un outil d’apprentissage automatique. Les données sont mesurées dans un système basé sur une file d’attente avec des ensembles de données de rotation allant jusqu’à 60° à partir de cristaux sélectionnés par l’utilisateur dans une plaque. Les données de tous les cristaux d’un puits ou d’un groupe d’échantillons particuliers sont automatiquement fusionnées à l’aide de xia2.multiplex, les sorties étant facilement accessibles via une interface de navigateur Web.

Introduction

La cristallographie aux rayons X reste un outil clé pour comprendre la structure et la fonction des protéines, en fournissant des structures à haute résolution des protéines ou de leurs complexes avec, par exemple, des substrats ou des candidats médicaments. Dans de nombreux cas, cependant, l’obtention de cristaux aux propriétés souhaitables - très diffractants, forme cristalline susceptible d’être trempée et sans pathologies cristallines telles que le jumelage - reste un goulot d’étranglement considérable¹. Comme les conditions chimiques appropriées pour produire des cristaux de protéines ne peuvent généralement pas être prédites, le criblage de cristallisation explorant des milliers de mélanges chimiques potentiels est standard, souvent aidé par l’automatisation/la robotique dans la mise en place d’écrans et d’hôtels à cristaux pour la surveillance, souvent à distance, des images de gouttes de cristallisation qui sont enregistrées.

Lorsque des cristaux apparaissent, ils doivent généralement être récoltés dans l’environnement de cristallisation à l’aide d’une boucle en nylon ou en Kapton, puis transférés dans une gouttelette contenant un agent de cryoprotection (dont la recherche est une variable supplémentaire) avant d’être plongés dans l’azote liquide. Ces étapes supplémentaires entre la cristallisation et la collecte de données radiographiques peuvent impliquer, entre autres facteurs, la déshydratation de la goutte de cristallisation lorsque son environnement scellé est rompu, des contraintes mécaniques sur le cristal lorsqu’il est manipulé et des dommages causés par les agents de cryoprotection au réseau cristallin (entraînant généralement une augmentation de la propagation de la mosaïque)². De plus, la récolte des cristaux demande beaucoup de temps et de main-d’œuvre et peut entraîner une inhomogénéité entre les échantillons, en particulier lorsque la peau se forme sur les gouttes pendant le processus de récolte. La ligne de lumière VMXi donne accès à des données utilisables à partir de cristaux collés à la plaque, qui seraient autrement rejetées pour la collecte de données.

La grande majorité des structures cristallines des rayons X sont déterminées à 100K à l’aide de l’approche ci-dessus, ce qui permet un transport et une manipulation simples des cristaux et augmente la durée de vie des cristaux dans le faisceau de rayons X de plusieurs ordres de grandeur. Cependant, on s’intéresse de plus en plus à la détermination des structures dans des conditions non cryogéniques, c’est-à-dire beaucoup plus proches des conditions physiologiques pertinentes pour la fonction protéique ^2,3,4. Cela permet une bien meilleure appréciation de la structure dynamique des protéines, évite que les conformations ou les boucles d’acides aminés ne soient gelées dans des états fonctionnellement non pertinents⁵, et permet d’explorer la liaison au ligand dans des conditions beaucoup plus proches de celles de l’environnement naturel de la protéine au sein de la cellule et de l’organisme⁶.

Une autre approche, mise en œuvre sur la ligne de lumière VMXi (Versatile Macromolecular Crystallography in situ) du synchrotron Diamond Light Source, au Royaume-Uni, consiste à mesurer les données de diffraction directement à partir des cristaux dans l’environnement dans lequel ils se sont développés (c’est-à-dire à l’intérieur de la plaque de cristallisation), dans des conditions ambiantes et sans perturbation ^7,8. Cela permet un retour d’information très rapide à partir des écrans de cristallisation et des optimisations pour guider un utilisateur vers une forme cristalline optimale pour ses besoins. Il permet également de produire de manière automatisée des structures à température ambiante de haute qualité⁹.

Ce protocole suppose qu’un utilisateur dispose d’un échantillon de protéine très pur prêt pour la cristallisation. Nous décrivons l’expérience de l’utilisateur accédant à l’installation de cristallisation de Harwell pour produire des cristaux de protéines, puis utiliser la ligne de lumière VMXi pour la collecte de données (Figure 1).

L’installation de cristallisation à Harwell

L’installation de cristallisation de Harwell (CF) est située dans le complexe de recherche de Harwell (RCaH) adjacent à la source de lumière Diamond. L’installation offre aux utilisateurs un laboratoire automatisé à haut débit pour la cristallisation macromoléculaire, utilisant la robotique pour le criblage de cristallisation, l’optimisation des cristaux, l’imagerie cristalline et la caractérisation. Grâce à une intégration étroite avec la ligne de lumière VMXi hautement automatisée, le rythme de détermination des structures à température ambiante s’est considérablement accéléré et permet la caractérisation de nouvelles structures protéiques, de complexes protéine-ligand et ADN-ligand, ainsi que le criblage automatisé de fragments (Figure 1), le tout dans des conditions non cryogéniques.

Le pipeline CF est constitué d’une suite d’instruments comprenant des robots de cristallisation nanolitres⁹ pour la cristallisation de protéines solubles et membranaires, des robots de manipulation de liquides pour préparer des cribles de cristallisation commerciaux et des cribles d’optimisation personnalisés complexes, et quatre instruments d’imagerie (un à 4 °C et trois à 20 °C pour l’imagerie des plaques de cristallisation (voir le tableau des matériaux). Un imageur est capable d’imager des plaques de verre en phase cubique lipidique (LCP) et un imageur est équipé d’optiques multi-fluorescence (toutes deux à 20 °C).

L’installation est maintenant largement utilisée par un large éventail d’utilisateurs universitaires et industriels, y compris le Laboratoire des protéines membranaires (MPL ; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), l’installation de criblage de fragments XChem ¹⁰, les lignes de lumière MX, le hub XFEL, ainsi que l’Institut Rosalind Franklin (RFI). Ce pipeline bien établi et optimisé a permis de réaliser des expériences de cristallisation dans un large éventail de projets de biologie structurale. Cet article décrit le pipeline de cristaux destinés à la collecte de données à VMXi, bien que les cristaux puissent également être récoltés et refroidis cryogéniquement ou dirigés vers le pipeline XChem.

L’accès des utilisateurs est attribué par le biais du système de proposition Diamond MX (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) et les utilisateurs industriels sont pris en charge par le groupe de liaison avec l’industrie du diamant. Tous les utilisateurs peuvent venir sur le site avec leur(s) échantillon(s) ou leur(s) plaque(s), qui peuvent être transportés à la main. Il n’est pas recommandé d’envoyer les plaques par coursier car notre expérience suggère que les gouttes peuvent s’éloigner de l’endroit où elles ont été distribuées, ou que les gouttes peuvent être endommagées par le réservoir de cristallisation. Alternativement, sur rendez-vous, les utilisateurs peuvent envoyer leurs échantillons de protéines aux FC, où les membres du personnel organisent des expériences de cristallisation en leur nom. Les expériences peuvent être surveillées à distance par l’utilisateur en se connectant à Rock Maker Web dans le cas de CF ou via ISPyB dans le cas de VMXi. L’accès au CF peut se faire de manière itérative sur la base des résultats de diffraction des rayons X recueillis à Diamond.

Ligne de faisceau VMXi à la source de lumière Diamond

La ligne de faisceau VMXi (ci-après dénommée « la ligne de faisceau ») est un instrument unique et récemment développé entièrement dédié à la cristallographie aux rayons X à température ambiante et hautement automatisée, en mettant l’accent sur la mesure des données des cristaux dans des plaques de cristallisation appropriées. La ligne de lumière offre un micro foyer (10 x 10 μm), un faisceau rose (^passe-bandede <5 × 10-2 ΔE/E) avec un flux élevé de ~2 ×^{10 13} photons/s (à 16 KeV)⁷. Ce faisceau à haut flux, couplé à un détecteur rapide, permet un débit très élevé d’échantillons et la collecte de données à partir d’échantillons d’une taille supérieure à 10 μm.

Les plaques de cristallisation entrent dans la ligne de faisceau en étant stockées dans un système de stockage d’échantillons et imagées en fonction du calendrier fourni par l’utilisateur lors de l’enregistrement des plaques à l’aide de l’interface ISPyB¹¹ SynchWeb¹². En règle générale, il est conseillé aux utilisateurs de sélectionner une séquence de Fibonacci de points temporels pour l’imagerie (0, 12, 24, 36, 60... 7 320 h à partir de l’entrée de la plaque dans le système). L’utilisateur est informé par email dès qu’une plaque a été imagée. L’imagerie en lumière visible et en lumière UV est disponible pour les utilisateurs sur demande. Les images prises par le système de stockage d’échantillons sont analysées par un algorithme d’apprentissage automatique ; Cela permet de localiser et de définir automatiquement les points d’intérêt des objets qui ressemblent à des cristaux et d’enregistrer les points d’intérêt prêts à être ajoutés par l’utilisateur à une file d’attente pour la collecte de données. Les utilisateurs peuvent également cliquer manuellement sur les images de lumière visible pour enregistrer des points d’intérêt ou cliquer et faire glisser une région à analyser par balayage matriciel. Ces points sont disponibles pour les utilisateurs qui peuvent les ajouter à la file d’attente en même temps que les points localisés automatiquement.

Une fois que tous les échantillons ont des paramètres appropriés pour la collecte des données, la plaque entre dans une file d’attente. Lorsque la plaque atteint le haut de la file d’attente, elle est automatiquement distribuée à la ligne de faisceau. Les plaques de cristallisation sont chargées automatiquement à partir des hôtels de cristal dans la ligne de faisceau par un bras robotisé, et après l’appariement des images, des ensembles de données cristallographiques d’une rotation allant jusqu’à 60° sont mesurés à partir de chaque cristal sélectionné selon les instructions définies par l’utilisateur. Toutes les gouttes à l’intérieur d’une plaque peuvent être utilisées pour ces expériences sur la ligne de faisceau. Les données sont fusionnées à partir de plusieurs cristaux pour produire de manière automatisée des ensembles de données isomorphes et fusionnés de manière optimale ^7,9. Une fois que tous les ensembles de données en file d’attente sont collectés, l’utilisateur reçoit un e-mail contenant un lien à suivre pour afficher les ensembles de données dans ISPyB¹¹, comme dans les autres lignes de faisceaux Diamond MX. Les utilisateurs sont également dirigés vers la page Web de la ligne de faisceau (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).

Protocole

1. Production de cristaux à l’intérieur de plaques in situ à l’aide de l’installation de cristallisation de Harwell

NOTA : L’accès au FC est pris en charge par un certain nombre de voies différentes et dépend de l’application du projet et du type d’utilisateur (universitaire ou industriel). Les projets XChem et MPL disposent de leur propre système de demande de proposition via le système d’administration des utilisateurs (UAS) et peuvent être soumis soit par la voie d’accès standard (y compris iNEXT Discovery et EUbOPEN), soit par l’accès BAG. Le protocole ci-dessous est spécifique aux utilisateurs de VMXi.

1. Soumission des propositions et préparation de la visite
   1. Fournissez des informations sur le projet à une demande de proposition BAG ou ajoutez-les à une proposition BAG active. Il y a généralement un coordinateur BAG, qui organise les formalités administratives. Vous pouvez également soumettre une proposition d’accès rapide pour accéder à la ligne de faisceau.
   2. S’assurer que l’échantillon a été enregistré et que la sécurité a été validée dans UAS sur une proposition avant l’arrivée sur place, soit par messagerie, soit en personne.
   3. Assurez-vous que l’utilisateur est enregistré (avec FedID et mot de passe).
   4. Assurez-vous que l’utilisateur a été ajouté à une proposition MX en tant qu’associé dans UAS par le coordinateur BAG.
   5. Remplissez le formulaire de détails de l’échantillon de cristallisation de la ligne de lumière et envoyez-le à VMXi@diamond.ac.uk.
   6. Communiquer avec le personnel de la ligne de faisceau au sujet des exigences de l’expérience et de la disponibilité de la ligne de faisceau.
   7. Si des échantillons de protéines sont expédiés, n’envoyez les échantillons que sur rendez-vous. Reportez-vous à la section 1.2 pour plus de détails.
   8. Si l’utilisateur doit se rendre sur le site pour installer des plaques de cristallisation dans le CF, vérifier auprès du personnel de l’installation la disponibilité d’un créneau horaire pour utiliser l’instrumentation de l’installation et suivre la section 1.2.1.
   9. Si l’utilisateur apporte des plaques sur le site, assurez-vous que l’échantillon est distribué dans le bon type de plaque et placez les gouttes de cristallisation au bon endroit et en bonne quantité. Suivre la section 1.2.2. La ligne de lumière n’accepte que des plaques de cristallisation in situ spécifiques (Greiner, CrystalQuickX et MiTeGen In Situ-1) ; s’assurer que les gouttes ne dépassent pas 200 nL.
2. Expérience de cristallisation menée dans la mucoviscidose
   REMARQUE : L’installation offre un certain nombre de méthodes de cristallisation macromoléculaire à haut débit telles que la diffusion de vapeur ainsi que la cristallisation par lots sous huile et LCP. Il est recommandé de commencer avec 70 à 100 μL de protéines pures et d’effectuer des expériences de diffusion de vapeur pour les protéines solubles avec trois cribles en utilisant un rapport de 100 nL de solution protéique et 100 nL de solution de réservoir de cristallisation et en incubant les plaques à 20 °C. Un certain nombre d’écrans commerciaux sont disponibles dans l’établissement. Le contrôle de l’humidité et de la température est disponible avec 4 °C et 20 °C les plus utilisés. Les utilisateurs qui visitent les FC reçoivent une formation et un soutien normalisés pour l’utilisation de l’instrument de cristallisation et utiliseront les paramètres décrits dans le présent document.
   1. Envoi d’échantillons pour l’installation aux FC
      REMARQUE : Avant l’arrivée sur place, l’échantillon de protéines doit avoir été validé sur une proposition dans le système UAS. Une fois que l’échantillon de protéine est arrivé sur place, les membres du personnel mettront en place des expériences de cristallisation comme indiqué dans les communications précédentes avec l’utilisateur. Une confirmation sera envoyée par e-mail avec les informations du code-barres pour les plaques de cristallisation expérimentales. Il sera demandé à l’utilisateur d’ajouter les plaques de cristallisation en tant que conteneurs à la proposition correspondante. Une fois que cela a été fait, les plaques peuvent être stockées dans des imageurs automatisés dans l’installation de cristallisation ou sur la ligne de faisceau. ISPyB sera l’interface utilisée pour l’interaction au niveau de la ligne de faisceau.
      1. Fournir la solution d’échantillon de protéine à la concentration pour la cristallisation en multiples de 25 μL d’aliquotes. Étiquetez clairement les tubes d’échantillon contenant l’échantillon de protéines.
      2. Si nécessaire, fournir une solution tampon de protéines, une solution de ligand ou une solution de réservoir.
      3. Informez le personnel de l’établissement des écrans et des taux de chute à utiliser.
   2. Réglages de la plaque de cristallisation
      REMARQUE : Nous exigeons que les gouttes de cristallisation dans la plaque Greiner CrystalQuickX et MiTeGen In Situ-1 soient dans un endroit particulier ; Les plaques installées ailleurs doivent utiliser les paramètres Mosquito¹³ suivants décrits ici.
      1. Pour ajuster la définition de la plaque pour MiTeGen In Situ-1, ouvrez le logiciel Mosquito SPT et cliquez sur la page de définition de la plaque MiTeGen In Situ-1 standard en cliquant sur Setup | 96 Well | MiTeGen In Situ-1 (96 x 2 gouttes) (Figure 2A). Cliquez sur le bouton d’édition et modifiez les valeurs de l’emplacement du sous-puits 2 : Décalage X à - 1,2 et Décalage Y à 1,8 et pour l’emplacement du sous-puits 3 : Décalage X à 1,3 et Décalage Y à 1,8 (Figure 2B,C).
      2. Pour ajuster la définition de la plaque pour Greiner CrystalQuickX, ouvrez le logiciel Mosquito SPT et cliquez sur la page de définition de la plaque Greiner CrystalQuickX standard en cliquant sur Configuration | 96 puits | Greiner CrystalQuickX (Figure 2D). Cliquez sur le bouton d’édition et modifiez les valeurs de l’emplacement du sous-puits 1 : Décalage X à - 1,95 et Décalage Y à 1,45 et pour l’emplacement du puits secondaire 2 : Décalage X à 1,95 et Décalage Y à 1,45 (Figure 2E,F).

2. Utilisation de la ligne de faisceau à la source de lumière Diamond

REMARQUE : Toutes les interactions avec la ligne de faisceau par les utilisateurs sont effectuées à distance à l’aide de l’interface ISPyB¹¹ . Aucune présence physique à la ligne de faisceau n’est requise et les données sont collectées à l’aide d’un système basé sur des files d’attente plutôt que d’être programmées à un moment donné. Les utilisateurs auront une proposition associée à leur accès à la Source de lumière Diamant. Au niveau de la ligne de faisceau, chaque plaque de cristallisation se voit attribuer une visite unique et est définie comme un « conteneur » dans ISPyB¹¹ , analogue à une rondelle contenant des échantillons à 100 K. Les écrans d’optimisation ne peuvent pas être créés à l’aide de l’interface SynchWeb et, par conséquent, les informations sont généralement ajoutées dans la section des commentaires (voir l’étape 2.1.4.). La personne qui enregistre la plaque devra vérifier l’adresse e-mail, car le propriétaire de la plaque recevra des e-mails concernant l’imagerie ainsi que des notifications de plaque terminée.

1. Plaques d’immatriculation
   1. Connectez-vous à ISPyB à l’aide d’un identifiant FedID Diamond approprié et sélectionnez Propositions. Recherchez la proposition qui vous intéresse en faisant défiler ou en tapant le numéro de la proposition dans la barre de recherche. Sélectionnez Expédition dans le menu déroulant sous le numéro de la proposition (Figure 3A), ce qui ouvrira la fenêtre Expéditions avec les expéditions de cette proposition. Cliquez sur +Ajouter un envoi en haut à droite (Figure 3B) pour ouvrir la fenêtre Ajouter un nouvel envoi , donnez un nom à l’envoi, cliquez sur Automatisé/Imageur, puis cliquez sur le bouton Ajouter un envoi en bas à gauche (Figure 3C).
   2. Dans la fenêtre d’expédition (Figure 3D), cliquez sur +Ajouter un conteneur, ce qui affichera alors la vue de la page Ajouter un conteneur (Figure 3E). Choisissez dans le menu déroulant Type de conteneur l’un des types de plaques appropriés. La page changera pour refléter le type de conteneur qui a été choisi. Entrez un code-barres et un nom de conteneur conformément aux instructions par e-mail du personnel de la ligne de faisceau spécifiques aux plaques expérimentales. Notez qu’il est sensible à la casse.
   3. Sélectionnez l’imageur VMXi 20 °C dans le menu déroulant Requested Imager (Imageur demandé ), la planification de l’imagerie de Fibonacci dans le menu déroulant Imaging Schedule (Programme d’imagerie ), l’écran de cristallisation dans le menu déroulant Crystallization Screen (Écran de cristallisation ) et le nom d’utilisateur dans le menu déroulant Owner (Propriétaire ), cliquez sur le bouton View ( Afficher ) et entrez l’adresse e-mail de contact correcte dans la zone E-mail (Figure 3F).
   4. Entrez plus de détails sur la plaque dans la zone Commentaires . Sélectionnez l’échantillon pertinent dans le menu déroulant Protéine et utilisez l’acronyme enregistré dans UAS et approuvé par Diamond dans la proposition expérimentale. Entrez le même nom dans la zone Nom de l’échantillon ; Laissez les boîtes restantes vides.
   5. Cliquez sur l’icône +Plaque pour répliquer l’échantillon sur l’ensemble de la plaque et remplir l’ensemble du conteneur avec des carrés verts. Cliquez sur +Ajouter un conteneur en bas de la page pour enregistrer la plaque. Demandez à un membre du personnel de la ligne de faisceau de transférer la plaque vers l’imageur approprié, où elle sera stockée et imagée. Une visite sera générée lorsque le conteneur sera stocké dans les imageurs et l’utilisateur recevra un e-mail avec un lien vers la plaque et ses images.
2. Affichage des résultats d’imagerie
   1. Naviguez jusqu’à la proposition qui vous intéresse (étapes 2.1.1), sélectionnez Conteneurs dans le menu déroulant sous le numéro de la proposition et observez la liste des conteneurs disponibles pour la proposition. Sélectionnez les plaques filtrantes si d’autres types de porte-échantillons sont présents. Pour affiner davantage la recherche, cochez la case Mes conteneurs pour n’afficher que les conteneurs les plus pertinents associés à l’ID utilisateur actuellement connecté. Cliquez sur le conteneur approprié en déplaçant le curseur sur la ligne individuelle et en cliquant avec le bouton gauche de la souris.
   2. Lors de la sélection du conteneur, une nouvelle vue s’affiche, montrant une vue d’ensemble de la plaque (Figure 4A). Cliquez sur une goutte dans la représentation de la plaque sur le côté gauche de l’écran pour afficher l’image la plus récente de cette goutte respective. Utilisez les touches fléchées pour naviguer entre les gouttes ou sélectionnez des gouttes individuelles à l’aide d’une souris/curseur.
   3. Pour afficher les images historiques d’une goutte, cliquez sur le bouton H et attendez qu’une galerie contextuelle d’images apparaisse sur l’image actuelle de la chute du puits. Placez le curseur sur les images individuelles pour mettre à jour l’image principale.
   4. Marquez les images pour indiquer l’état de chaque goutte en appuyant sur les boutons 0 à 9 . Pour voir les catégories individuelles, ouvrez le menu déroulant Score en haut à gauche de l’image de dépôt. Recherchez des croix bleues dans chacune des images de goutte, qui sont le résultat d’un algorithme (CHiMP) entraîné à rechercher des « cristaux » dans les images.
   5. Cliquez sur le bouton de la troisième icône appelé Mesurer en haut à droite de l’image pour accéder à un outil de mesure. Pour utiliser cet outil, cliquez sur une ligne et faites-la glisser, et une règle s’étendra et donnera la distance en μm.
   6. Pour demander une session d’imagerie supplémentaire, cliquez sur Visible ou UV dans la liste déroulante située en bas de la page . Cliquez ensuite sur le bouton Demander l’imagerie de la plaque .
3. Sélection des cristaux/CHiMP
   1. Pour ajouter des points pour la collecte manuelle de données, appuyez sur le bouton +Marquer le point . Passez le curseur sur le point d’intérêt souhaité et sélectionnez-le. Attendez qu’une croix rouge apparaisse.
      REMARQUE : Il est possible de créer jusqu’à 100 objets par goutte.
   2. Lorsque tous les points sont marqués, cliquez sur le bouton +Terminer . N’oubliez pas de cliquer également sur le bouton +Terminer avant d’essayer de mesurer des objets. Pour ajouter des régions pour la collecte de données via des balayages de grille, cliquez sur le bouton +Marquer la région . Cliquez sur le point en haut à gauche et faites-le glisser vers le bas et vers la droite pour créer une région qui sera balayée en raster sur la ligne de faisceau. Comme pour les points, cliquez sur le bouton +Terminer lorsque toutes les régions souhaitées sont créées.
      REMARQUE : Il est préférable de créer une région plus grande que de nombreuses petites régions.
   3. Observez les croix bleues déjà présentes sur les images de goutte, qui sont le résultat d’un algorithme conçu pour localiser automatiquement les objets cristallins (CHiMP). Pour visualiser l’évaluation CHiMP des gouttes de cristallisation, cochez la case Afficher les scores automatiques , puis modifiez le menu déroulant pour Classe. En règle générale, le paramètre le plus utile ici est l’option cristal (Figure 4B).
      REMARQUE : Il s’agit d’une nouvelle fonctionnalité et il n’est pas garanti de trouver tous les cristaux et peut également trouver d’autres objets qui ne sont pas des cristaux.
   4. Lorsque tous les points et régions ont été marqués dans les dépôts respectifs, cliquez sur le bouton Préparer la collecte de données en bas de la page.
4. Préparation des échantillons pour la collecte de données
   1. Observez la liste des échantillons contenant les points ou les régions sélectionnés à l’étape précédente, ou localisés automatiquement (Figure 4C). Ajoutez des points ou des régions individuels en appuyant sur le bouton + ou ajoutez tous les échantillons affichés en cliquant sur le bouton Ajouter la page actuelle à la file d’attente .
   2. Les filtres sont disponibles pour afficher uniquement les points Point, Région, Auto ou Manuel. Pour afficher uniquement les échantillons qui n’ont pas été photographiés (c’est-à-dire exposés aux rayons X), cliquez sur les options Sans données et Non terminé au-dessus des boutons de filtre.
   3. Sélectionnez des échantillons individuels en cliquant sur la ligne correspondante et mettez à jour l’image sur le côté droit de l’écran pour afficher le point de chute et le point individuel corrects. S’il y a beaucoup d’échantillons dans la liste, augmentez le nombre d’échantillons affichés par page en sélectionnant le menu déroulant avec 10 par défaut et jusqu’à 100 comme nombre maximal d’échantillons affichés.
   4. Une fois que tous les points et régions ont été ajoutés à la file d’attente, assurez-vous que tous les paramètres de collecte de données expérimentales sont associés à chaque expérience.
      1. Utilisez des filtres pour Point, Région, Manuel et Auto. Cliquez sur le filtre Point et cochez la case Sélectionner tout sous les boutons de filtre pour appliquer simultanément des paramètres à tous les échantillons visibles dans la liste actuelle des échantillons en file d’attente .
      2. Sélectionnez les paramètres expérimentaux dans le menu déroulant situé sur le côté droit de l’écran, sous la photo de dépôt (Figure 4D). Pour les régions, sélectionnez l’option Grid Scan DMM par pas de 10 microns, transmission à 100 %. Pour toutes les autres expériences ponctuelles , sélectionnez d’autres options dans le menu déroulant, le cas échéant.
      3. Pour les collectes de données d’oscillation, cliquez sur l’option Omega Scan DMM 60 degrés 5 % de transmission pour collecter la quantité maximale de données d’un échantillon individuel. Appliquez de petites rotations pour les très petits cristaux ou les échantillons sensibles aux rayonnements et faites varier la transmission en fonction de l’expérience antérieure avec une forme cristalline particulière. Une fois que les paramètres expérimentaux sont correctement appliqués à tous les échantillons, cliquez sur le bouton Conteneur de file d’attente en bas de la page.
   5. Une fois que la plaque a atteint le haut de la file d’attente, elle sera présentée à la ligne de faisceau, les jeux de données seront collectés, puis elle retournera à nouveau au stockage de l’échantillon dans la ligne de faisceau. Une fois la collecte des données d’une plaque terminée, recherchez un e-mail avec un lien à suivre pour accéder aux données pertinentes.
5. Création de groupes d’échantillons
   REMARQUE : Des groupes d’échantillons peuvent être créés pour regrouper des échantillons similaires sur plusieurs gouttes ou plaques. Tous les jeux de données au sein de ces groupes d’échantillons seront traités à l’aide du pipeline xia2.multiplex¹⁴ une fois traités par DIALS. Cela peut être utile lors de la collecte de nombreux très petits blocs de données et peut également être utile pour augmenter le rapport signal/bruit pour les expériences de liaison aux ligands.
   1. Sélectionnez Gestion des groupes d’échantillons dans le menu déroulant sous le numéro de la proposition. Recherchez une liste de groupes s’ils ont déjà été créés par d’autres utilisateurs. Pour générer un nouveau groupe, cliquez sur le bouton +Créer un exemple de groupe . Cliquez sur un envoi dans le menu déroulant de la page Créer un groupe d’échantillons pour afficher l’exemple de visionneuse (Figure 5A). Cliquez sur le conteneur contenant les échantillons pertinents dans la liste renseignée.
   2. Lorsque vous avez cliqué sur un conteneur, recherchez un graphique montrant la vue d’ensemble de la plaque.
   3. Cliquez sur les gouttes individuellement en cliquant sur la goutte individuelle (Figure 5B) ou cliquez sur les gouttes dans les lignes ou les colonnes en cliquant sur la lettre de ligne ou le numéro de colonne approprié. Lorsque tous les puits associés à un groupe individuel ont été sélectionnés, entrez un nom pour le groupe dans la zone Nom du groupe d’échantillons , puis cliquez sur le bouton Enregistrer le groupe d’échantillons . Cliquez sur le bouton Afficher les groupes d’échantillons sur cette page pour revenir à la liste des groupes d’échantillons déjà générés associés à la proposition (Figure 5C).
6. Modification des groupes d’échantillons
   1. Cliquez sur un exemple de groupe dans la liste des groupes de la page Gestion des exemples de groupes .
   2. Cliquez sur le bouton +Edit Sample Group (Modifier le groupe d’échantillons ) à côté des conteneurs qui apparaissent sous les informations sur le groupe (Figure 5C).
   3. Observez les gouttes, déjà associées à un groupe d’échantillons, mises en évidence sur l’aperçu de la plaque.
   4. Ajoutez d’autres gouttes au groupe d’échantillons en cliquant sur Gouttes, Puits ou Colonnes comme précédemment.
      REMARQUE : Les gouttes ne peuvent pas être retirées d’un groupe d’échantillons.
   5. Une fois que d’autres gouttes ont été ajoutées, modifiez le nom du groupe d’échantillons , puis enregistrez-le, ou enregistrez-le simplement en cliquant sur le bouton Enregistrer le groupe d’échantillons .
7. Visualisation et analyse des résultats des groupes d’échantillons
   1. Cliquez sur un groupe individuel dans la liste des groupes d’échantillons pour afficher la vue d’ensemble des plaques du ou des conteneurs associés au groupe. Les gouttes incluses dans le groupe seront mises en évidence sur cet écran (Figure 5D).
   2. Recherchez une liste contenant les trois derniers travaux de multiplexage chronologiques si des données ont été collectées dans ce groupe.
   3. Cliquez sur la ligne d’une exécution de multiplex pour mettre à jour les résultats de traitement ci-dessous.
   4. Observez le bouton de lien rapide , qui indique le nombre de jeux de données associés au groupe. Cliquez sur ce bouton pour ouvrir une nouvelle page Collections de données affichant les collections de jeux de données individuelles.

3. Accès au traitement automatisé des données

REMARQUE : Une fois que les données ont été collectées, elles sont transmises à plusieurs pipelines de traitement automatique des données. Les quatre pipelines standard utilisés sur les lignes de faisceau MX à Diamond sont également exploités à partir des données recueillies sur la ligne de faisceau. Il s’agit de 'fast_dp', 'xia2 dials', 'xia2 3dii' et '^autoPROC'15. 'fast_dp' fournira une réduction rapide des données pour évaluer rapidement la qualité. Les trois autres pipelines nécessiteront plus de temps de calcul et exécuteront une variété de progiciels de réduction de données différents à des fins de comparaison. En conséquence, la sortie est généralement de meilleure qualité que la sortie « fast_dp ». Les ensembles de données collectés sur la ligne de faisceau passeront également par le logiciel de fusion automatique multicristallines 'xia2.multiplex'14, qui fusionnera tous les ensembles de données au sein d’un groupe défini. Notez que bien que les scans de grille ne soient actuellement pas traités automatiquement, les données peuvent être traitées manuellement à l’aide du pipeline 'xia2.ssx'. Les résultats des pipelines de traitement automatique sont disponibles dans ISPyB¹¹ à l’aide du protocole suivant.

1. Localisation des jeux de données
   1. Connectez-vous à ISPyB comme décrit ci-dessus et sélectionnez Propositions.
   2. Recherchez la proposition qui vous intéresse en faisant défiler ou en tapant le numéro de la proposition dans la barre de recherche.
   3. Cliquez sur la visite souhaitée dans la liste qui s’affiche à l’écran pour accéder à la fenêtre Collections de données de cette visite.
   4. Appliquez les filtres souhaités.
      REMARQUE : Un filtre populaire est le filtre « Intégration automatique », qui n’affiche que les jeux de données qui ont été exécutés avec succès dans un ou plusieurs pipelines de traitement. Cela exclura les analyses de grille, car elles ne sont actuellement pas traitées automatiquement par ISPyB.
   5. Faites défiler la page vers le bas pour trouver le jeu de données qui vous intéresse.
      REMARQUE : Chaque jeu de données affichera l’ID de l’échantillon, les paramètres expérimentaux utilisés, une visionneuse d’images de diffraction, une visionneuse d’images cristallines et un tracé d’analyse par image pour une observation rapide de la qualité des données.
2. Pour accéder aux résultats du traitement automatique
   1. Cliquez sur l’onglet Traitement automatique sous le résumé des données d’une expérience spécifique pour inspecter les résultats de la réduction automatique des données (Figure 6A).
   2. Cliquez sur les différents onglets correspondant aux différents pipelines pour voir un résumé détaillé de chaque sortie.
      REMARQUE : Si des groupes d’échantillons ont été définis, il y aura deux onglets correspondant aux tâches multiplexes. L’un correspondra à la fusion de tous les jeux de données du groupe jusqu’à ce point, tandis que l’autre correspondra à la fusion des jeux de données au sein de ce dépôt uniquement.
   3. Cliquez sur le bouton Journaux et fichiers pour télécharger les fichiers .mtz résultants si le traitement a réussi et tous les fichiers journaux associés. Cliquez sur l’onglet Traitement en aval sous la section Traitement automatique pour afficher la sortie de DIMPLE.
      REMARQUE : DIMPLE ne s’exécutera que si un fichier PDB a été fourni lors de l’envoi de l’échantillon.
   4. Cliquez sur le bouton Logs & Files pour télécharger n’importe quelle sortie résultante de DIMPLE.
3. Pour accéder aux résultats du multiplexage de groupe, ouvrez le menu déroulant en haut de l’écran avec le numéro de proposition inscrit dessus et cliquez sur Gestion des groupes d’échantillons. Cliquez sur la ligne correspondant au groupe souhaité dans le bon conteneur. Faites défiler vers le bas pour trouver la liste des sorties multiplex correspondant au groupe tel que représenté visuellement par un schéma de la plaque.
   1. Cliquez sur la sortie multiplex souhaitée dans la liste indiquée. Cliquez sur le bouton xxx Data Sets (Ensembles de données xxx ), où xxx correspond au nombre de jeux de données fusionnés (Figure 6B).
      REMARQUE : L’écran Collections de données s’ouvre, mais seuls les jeux de données de la tâche multiplex sélectionnée s’affichent.
   2. Cliquez sur l’onglet Traitement automatique de l’expérience supérieure.
   3. Cliquez sur l’onglet Traitement multiplex qui correspond au nombre correct de jeux de données fusionnés.
   4. Cliquez sur le bouton Logs & Files pour télécharger le fichier .mtz et les fichiers journaux correspondants (comme à l’étape 3.2.3).
4. Pour accéder aux résultats de l’analyse de la grille
   1. Accédez à l’écran Collections de données de la visite souhaitée. Les résultats des données de balayage de la grille seront affichés à côté de toutes les données de rotation collectées.
      REMARQUE : Il n’y aura pas de résultats de traitement automatique.
   2. L’image de la goutte de cristal aura la grille recouverte d’une carte thermique représentant la présence de diffraction. Cliquez sur un carré pour afficher l’image de diffraction correspondant à cette position dans la grille. Cliquez sur le menu déroulant en haut de l’image du puits de cristal pour modifier ce que représente la carte thermique. La valeur par défaut est l’intensité totale de la diffraction, mais elle peut être remplacée par le nombre total de taches, la résolution estimée ou les images sans glace.

4. Retraitement des données

REMARQUE : Les jeux de données sélectionnés peuvent être retraités via l’interface ISPyB¹¹ à l’aide des mêmes pipelines de traitement qui sont exécutés automatiquement avec les paramètres modifiés définis par l’utilisateur. Un seuil de résolution peut être appliqué ; Si la symétrie/cellule du cristal est connue, elle peut également être définie pour s’assurer que les pipelines de traitement fonctionnent dans le bon réglage. Certaines plages d’images dans des jeux de données spécifiques peuvent également être fusionnées à l’aide des pipelines multicristaux disponibles. Cela peut s’avérer avantageux si les dommages causés par les rayonnements systématiques entraînent une mauvaise qualité de la dernière partie des images de diffraction. Il est également possible pour l’utilisateur de télécharger ses jeux de données en utilisant le protocole décrit ci-dessus et d’exécuter localement le logiciel de retraitement de son choix, dont les didacticiels sont disponibles gratuitement ailleurs (https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ).

1. Pour retraiter plusieurs jeux de données individuels
   1. Connectez-vous à ISPyB et accédez aux ensembles de données qui vous intéressent (étape 3.1).
   2. Cliquez sur un jeu de données , puis sur l’icône en forme de roue dentée dans la barre de titre du jeu de données (Figure 6) pour ouvrir la fenêtre de retraitement.
   3. Configurez les paramètres souhaités et sélectionnez les images qui seront incluses dans le retraitement.
      REMARQUE : La plage d’images peut être définie soit en tapant une plage dans les zones étiquetées, soit en cliquant et en faisant glisser la région souhaitée dans le tracé d’analyse par image (Figure 7A).
   4. FACULTATIF : Pour ajouter un autre jeu de données pour un retraitement individuel, cliquez sur son icône en forme de roue dentée et il apparaîtra dans la fenêtre de retraitement sous le premier jeu de données. Cochez la case Traiter individuellement.
   5. Cliquez sur le bouton Intégrer .
2. Pour retraiter des données multicristaux
   1. Ouvrez la fenêtre de retraitement à partir de n’importe quel jeu de données.
   2. Cliquez sur le bouton Multicristal pour ouvrir un nouvel écran.
   3. Faites défiler vers le bas pour trouver une série de graphiques d’analyse par image à partir d’expériences menées pendant la visite.
   4. Choisissez un pipeline de traitement dans le menu déroulant.
   5. FACULTATIF : Définissez des limites de résolution ou des paramètres de cellule unitaire connus.
   6. Cliquez et faites glisser pour définir les plages d’images à inclure dans le retraitement multicristallin (Figure 7).
      REMARQUE : Cette opération doit être effectuée sur plusieurs tracés différents afin que les jeux de données de plusieurs cristaux différents soient fusionnés.
   7. Cliquez sur le bouton Integrate (Intégrer ) (Figure 7B).
3. Pour accéder aux données retraitées
   1. Accédez à la page Collections de données de la visite spécifique (étapes 3.1.1 à 3.1.3).
   2. Cliquez sur le bouton Retraitement en haut de l’écran.
   3. Faites défiler vers le bas pour localiser la tâche souhaitée.
   4. Cliquez sur le chemin d’accès au fichier dans la colonne de droite pour ouvrir l’écran Collections de données pour les données retraitées.
   5. Ouvrez l’onglet Traitement automatique et téléchargez les données comme décrit précédemment (étape 3.2).
      REMARQUE : Tous les travaux de retraitement sont identifiables par le symbole des flèches circulaires à côté du nom du pipeline.

Discussion

Nous avons décrit la procédure complète depuis l’arrivée d’un échantillon de protéines dans le CF jusqu’au téléchargement des données finales par l’utilisateur pour d’autres applications. Les étapes critiques sont la production d’un échantillon de protéines de haute qualité et de cribles cristallins appropriés, soit à l’aide de cribles à matrice creuse commerciale, soit à l’aide de cribles d’optimisation basés sur des conditions établies. Ce processus peut avoir lieu dans les FC, ou les utilisateurs peuvent effectuer les procédures de cristallisation dans les laboratoires d’origine et apporter des plaques de cristallisation appropriées à la ligne de faisceau. L’identification de paramètres de collecte de données appropriés peut être importante pour certains échantillons, en particulier lorsque les dommages causés par les rayonnements sont préoccupants. Dans la plupart des cas, le traitement automatisé des données est tout à fait suffisant pour répondre à la question scientifique, bien que les utilisateurs conservent la possibilité de procéder à un retraitement à l’aide des outils de ligne de faisceau, par exemple, lorsque le groupe spatial est ambigu ou que seule la partie initiale des données collectées est utilisée pour minimiser les effets des dommages causés par les rayonnements.

Si des cristaux appropriés ne sont pas produits à partir des essais de cristallisation initiaux, des changements dans la concentration en protéines, la pureté ou les écrans de cristallisation peuvent être explorés, tout comme l’utilisation de l’ensemencement des cristaux. Si les cristaux ne se diffractent pas à une résolution utile à la ligne de faisceau, des balayages de grille peuvent être utilisés avec un faisceau non atténué pour évaluer la limite de diffraction inhérente et la cellule unitaire des cristaux afin de guider les efforts d’optimisation. Les cristaux qui sont trop petits pour la collecte de données à l’intérieur des plaques (par exemple, <10 μm) peuvent plutôt convenir à la cristallographie en série ou aux expériences de nanofocalisation (par exemple, à la ligne de faisceau Diamond VMXm). La résolution de structures à l’aide de données VMXi est généralement simple par remplacement moléculaire, en particulier depuis l’avènement d’Alphafold¹⁶ pour donner des modèles de recherche efficaces. Si cela ne réussit pas, les cristaux peuvent être récoltés et cryorefroidis à partir de plaques pour permettre des expériences conventionnelles de diffraction anormale à une seule longueur d’onde, de diffraction anormale à plusieurs longueurs d’onde ou de phase à grande longueur d’onde.

Les avantages de cette méthode incluent la possibilité d’obtenir des ensembles de données rapides et de haute qualité et un retour d’information directement à partir des plaques de cristallisation sans avoir besoin de perturber les cristaux des environnements dans lesquels ils se sont développés. Ce que l’on appelle la « renaissance à température ambiante » en biologie structurale privilégie les structures obtenues dans des conditions non cryogéniques pour permettre d’explorer davantage la pertinence physiologique et la dynamique des protéines². Habituellement, une résolution légèrement inférieure est obtenue par rapport à un cristal cryorefroidi optimisé, mais seulement lorsque des conditions cryogéniques appropriées ont été établies et si les cristaux sont robustes à la manipulation mécanique et à l’ouverture de la goutte de cristallisation³. Une application à venir pour laquelle ce pipeline est très bien adapté est le criblage à grande échelle de complexes protéine-ligand ou de campagnes de fragments à température ambiante dans la découverte de médicaments. Les ligands ou les fragments peuvent être cocristallisés ou ajoutés par pipette ou par éjection de gouttes acoustiques avant la collecte de données à température ambiante. Une autre application consiste à mesurer rapidement les données de plusieurs centaines ou milliers de cristaux de manière très efficace, puis à utiliser le logiciel DIALS¹⁷ multiplex¹⁴ pour extraire des amas isomorphes qui peuvent représenter différentes entités biologiques ou pour établir des différences statistiquement significatives entre des populations de cristaux qui ont été traités d’une manière différente ou exposés à des ligands ou des signaux différents.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formulator	Formulatrix	on request	Liquid handling robot
Formulatrix imager	Formulatrix	on request	Crystallisation plate imager
Greiner CrystalQuick X	Greiner	Z617644	Crystallisation plate
Gryphon	Art Robbins Instruments	620-1000-10	Crystalisation robot
MiTeGen Insitu-1	Mitegen	InSitu-01CL-40	Crystallisation plate
Mosquito LCP	(SPT Labtech)	on request	Crystallisation robot
Rock Imager & Maker	Formualtrix	on request	Software for Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
Scorpion	Art Robbins Instruments	640-1000-10	Liquid handling robot https://www.artrobbins.com/scorpion