Capture de l’agitation basée sur le cytosquelette du noyau de l’ovocyte de souris à travers les échelles spatiales

Résumé

Ce protocole fournit un cadre expérimental pour documenter l’impact physique du cytosquelette sur la forme nucléaire et les organites internes sans membrane dans le système ovocytaire de la souris. Le cadre peut être adapté pour être utilisé dans d’autres types de cellules et contextes.

Résumé

Un défi majeur pour comprendre les causes de l’infertilité féminine est d’élucider les mécanismes régissant le développement des cellules germinales féminines, appelées ovocytes. Leur développement est marqué par la croissance cellulaire et les divisions ultérieures, deux phases critiques qui préparent l’ovocyte à la fusion avec le spermatozoïde pour initier l’embryogenèse. Au cours de la croissance, les ovocytes réorganisent leur cytoplasme pour positionner le noyau au centre de la cellule, un événement prédictif du développement réussi des ovocytes chez la souris et l’homme et, par conséquent, de leur potentiel embryogénique. Chez les ovocytes de souris, il a été démontré que cette réorganisation cytoplasmique est entraînée par le cytosquelette, dont l’activité génère des forces mécaniques qui agitent, repositionnent et pénètrent dans le noyau. Par conséquent, cette transmission de force cytoplasmique-nucléoplasmique ajuste la dynamique des organites de traitement de l’ARN nucléaire connus sous le nom de condensats biomoléculaires. Ce protocole fournit un cadre expérimental pour documenter, avec une haute résolution temporelle, l’impact du cytosquelette sur le noyau à travers les échelles spatiales dans les ovocytes de souris. Il détaille les étapes et les outils d’imagerie et d’analyse d’images nécessaires pour évaluer i) l’activité cytosquelettique dans le cytoplasme de l’ovocyte, ii) l’agitation du noyau ovocytaire par le cytosquelette, et iii) ses effets sur la dynamique biomoléculaire des condensats dans le nucléoplasme de l’ovocyte. Au-delà de la biologie des ovocytes, les méthodes élaborées ici peuvent être adaptées pour être utilisées dans les cellules somatiques afin d’aborder de la même manière l’ajustement de la dynamique nucléaire basé sur le cytosquelette à toutes les échelles.

Introduction

Le positionnement nucléaire est essentiel pour de multiples fonctions cellulaires et développementales 1,2,3,4,5. Les cellules germinales femelles de mammifères appelées ovocytes remodèlent leur cytoplasme pour positionner le noyau au centre de la cellule malgré une division asymétrique de la taille, qui repose sur un décentrage chromosomique ultérieur⁶ (Figure 1). Ce centrage du noyau prédit le développement réussi des ovocytes chez la souris et l’homm....

Protocole

Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux directives de la Communauté européenne et ont été approuvées par le ministère français de l’Agriculture (autorisation n° 75-1170) et par la Direction générale de la recherche et de l’innovation (DGRI ; Numéro d’accord OGM DUO-5291). Les souris ont été hébergées dans l’animalerie selon un cycle lumière/obscurité de 12 heures, avec une température ambiante de 22 à 24 °C et une humidité de 40 % à 50 %. Les souris utilisées ici comprennent la femelle OF1 (Oncins France 1, âgée de 8 à 12 semaines) et la femelle C57BL/6 (âgée de 10 à 14 semaines).

1. Prélèvement et prép....

Discussion

Les étapes clés de ce protocole comprennent une micro-injection appropriée d’ovocytes sans affecter leur survie ou leur fonction normale ^9,10,11, ainsi que la micro-injection de quantités prédéfinies d’ARNc qui permettraient une visualisation correcte des structures pertinentes, comme les taches nucléaires.

Établir le lien entre la dynamique cytoplasmique et la dynamique (intra)nucléaire .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A3311
CSU-X1-M1 spinning disk	Yokogawa
DMI6000B microscope	Leica
Femtojet microinjector	Eppendorf
Fiji
Filter wheel	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software	Universal Imaging,		version 7.7.9.0
Mineral oil	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice	Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3 CCD camera	QImaging
RNAeasy kit	Qiagen	74104
SC35 antibody	Abcam	ab11826	Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid	OriGene Technologies	MG202528	NM_011358
Stripper Micropipette	XLAB Solutions		specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384
T7 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM13344
Thermostatic chamber	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows