Application du graphène monocouche aux grilles de cryo-microscopie électronique pour la détermination de la structure à haute résolution

Résumé

L’application de couches de support aux grilles de microscopie électronique cryogénique (cryoEM) permet d’augmenter la densité des particules, de limiter les interactions avec l’interface air-eau, de réduire les mouvements induits par les faisceaux et d’améliorer la distribution des orientations des particules. Cet article décrit un protocole robuste pour le revêtement des grilles cryoEM avec une monocouche de graphène afin d’améliorer la préparation des échantillons cryogéniques.

Résumé

En microscopie électronique cryogénique (cryoEM), des macromolécules purifiées sont appliquées sur une grille portant une feuille de carbone trouée ; Les molécules sont ensuite tamponnées pour éliminer l’excès de liquide et rapidement congelées dans une couche de glace vitreuse d’environ 20 à 100 nm d’épaisseur, suspendue à travers des trous de feuille d’environ 1 μm de large. L’échantillon obtenu est imagé à l’aide de la microscopie électronique à transmission cryogénique et, après traitement de l’image à l’aide d’un logiciel approprié, des structures de résolution quasi atomique peuvent être déterminées. Malgré l’adoption généralisée de la cryoEM, la préparation des échantillons reste un goulot d’étranglement important dans les flux de travail cryoEM, les utilisateurs rencontrant souvent des problèmes liés au mauvais comportement des échantillons dans la glace vitrée en suspension. Récemment, des méthodes ont été développées pour modifier les grilles cryoEM avec une seule couche continue de graphène, qui agit comme une surface d’appui qui augmente souvent la densité des particules dans la zone d’imagerie et peut réduire les interactions entre les particules et l’interface air-eau. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour l’application du graphène aux grilles cryoEM et pour évaluer rapidement l’hydrophilie relative des grilles résultantes. De plus, nous décrivons une méthode basée sur EM pour confirmer la présence de graphène en visualisant son diagramme de diffraction caractéristique. Enfin, nous démontrons l’utilité de ces supports de graphène en reconstruisant rapidement une carte de densité d’une résolution de 2,7 Å d’un complexe Cas9 à l’aide d’un échantillon pur à une concentration relativement faible.

Introduction

La microscopie électronique cryogénique à particule unique (cryoEM) est devenue une méthode largement utilisée pour visualiser les macromolécules biologiques¹. Alimentée par les progrès de la détection directe d’électrons ^2,3,4, de l’acquisition de données⁵ et des algorithmes de traitement d’images ^6,7,8,9,10, la cryoEM est désormais capable de produire des structures 3D à résolution quasi a....

Protocole

1. Préparation du graphène CVD

1. Préparez la solution de gravure au graphène comme décrit ci-dessous.
   1. Dissoudre 4,6 g de persulfate d’ammonium (APS) dans 20 mL d’eau de qualité moléculaire dans un bécher de 50 mL pour obtenir une solution de 1 M et couvrir de papier d’aluminium. Laissez l’APS se dissoudre complètement tout en passant à l’étape 1.2.
2. Préparez une section de graphène CVD pour le revêtement en méthacrylate de méthyle (MMA). Coupez soigneusement une section carrée de graphène CVD. Transférez le carré sur une lamelle (50 mm x 24 mm) dans une boîte de Pétri propre et couvrez-la pendant le transport vers l....

Discussion

La préparation d’échantillons cryoEM implique une multitude de défis techniques, la plupart des flux de travail exigeant des chercheurs qu’ils manipulent manuellement des grilles fragiles avec un soin extrême pour éviter de les endommager. De plus, l’aptitude d’un échantillon à la vitrification est imprévisible ; Les particules interagissent souvent avec l’interface air-eau ou avec la feuille de support solide qui recouvre les grilles, ce qui peut conduire les particules à adopter des orientations pré.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 mL beaker (3x)	Fisher	02-555-25B
50 mL beaker (2x)	Corning	1000-50
Acetone	Fisher	A949-4
Aluminum foil	Fisher	15-078-292
Ammonium persulfate	Fisher	(I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm	Mattek	PCS-1.5-5024
CVD graphene	Graphene Supermarket	CVD-Cu-2x2
easiGlow discharger	Ted-Pella	91000S
Ethanol	Millipore-Sigma	1.11727
Flat-tip tweezers	Fisher	50-239-60
Glass cutter	Grainger	21UE26
Glass petri plate and cover	VWR	75845-544
Glass serological pipette	Fisher	13-676-34D
Grid Storage Case	EMS	71146-02
Hot plate	Fisher	07-770-108
Isopropanol	Sigma	W292907
Kimwipe	Fisher	06-666
Lab scissors	Fisher	13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6	Kayaku	MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water	Corning	46-000-CM
Negative action tweezers (2x)	Fisher	50-242-78
P20 pipette	Rainin	17014392
P200 pipette	Rainin	17008652
Parafilm	Fisher	13-374-12
Pipette tips	Rainin	30389291
Quantifoil grids with holey carbon	EMS	Q2100CR1
Spin coater	SetCas	KW-4A	with chuck SCA-19-23
Straightedge	ULINE	H-6560
Thermometer	Grainger	3LRD1
UV/Ozone cleaner	BioForce	SKU: PC440
Vacuum desiccator	Thomas Scientific	1159X11
Whatman paper	VWR	28297-216