Imagerie multiplexe de cellules vivantes pour les réponses médicamenteuses dans des modèles organoïdes de cancer dérivés de patients

Résumé

Les organoïdes tumoraux dérivés de patients sont un système modèle sophistiqué pour la recherche fondamentale et translationnelle. Cet article sur les méthodes détaille l’utilisation de l’imagerie fluorescente multiplexée de cellules vivantes pour l’évaluation cinétique simultanée de différents phénotypes d’organoïdes.

Résumé

Les modèles organoïdes dérivés de patients (PDO) du cancer sont un système de recherche multifonctionnel qui récapitule mieux les maladies humaines par rapport aux lignées cellulaires cancéreuses. Des modèles PDO peuvent être générés en cultivant des cellules tumorales de patients dans des extraits de membrane basale extracellulaire (BME) et en les plaquant sous forme de dômes tridimensionnels. Cependant, les réactifs disponibles dans le commerce qui ont été optimisés pour les tests phénotypiques dans les cultures monocouches ne sont souvent pas compatibles avec l’EMO. Dans cet article, nous décrivons une méthode pour mettre en plaque des modèles PDO et évaluer les effets des médicaments à l’aide d’un système automatisé d’imagerie de cellules vivantes. De plus, nous appliquons des colorants fluorescents compatibles avec les mesures cinétiques pour quantifier simultanément la santé cellulaire et l’apoptose. La capture d’image peut être personnalisée pour se produire à intervalles réguliers sur plusieurs jours. Les utilisateurs peuvent analyser les effets des médicaments dans des images individuelles du plan Z ou une projection Z d’images en série à partir de plusieurs plans focaux. Le masquage permet de calculer des paramètres d’intérêt spécifiques, tels que le nombre de PDO, la surface et l’intensité de fluorescence. Nous fournissons des données de preuve de concept démontrant l’effet des agents cytotoxiques sur la santé, l’apoptose et la viabilité des cellules. Cette plateforme d’imagerie cinétique automatisée peut être étendue à d’autres lectures phénotypiques pour comprendre divers effets thérapeutiques dans les modèles PDO du cancer.

Introduction

Les organoïdes tumoraux dérivés de patients (DO) apparaissent rapidement comme un système modèle robuste pour étudier le développement du cancer et les réponses thérapeutiques. Les PDO sont des systèmes de culture cellulaire tridimensionnels (3D) qui récapitulent le profil génomique complexe et l’architecture de la tumeur primaire ^1,2. Contrairement aux cultures bidimensionnelles (2D) traditionnelles de lignées cellulaires cancéreuses immortalisées, les AOP capturent et maintiennent l’hétérogénéité intratumorale ^3,4, ce qui en fait un outil précieux pour la recherche mécaniste et translationnelle. Bien que les AOP deviennent un système modèle de plus en plus populaire, les réactifs disponibles dans le commerce et les méthodes d’analyse des effets cellulaires compatibles avec les cultures d’ODP sont limités.

Le manque de méthodes robustes pour analyser les changements subtils dans la réponse au traitement entrave la traduction clinique. Le réactif de référence pour la santé cellulaire dans les cultures 3D, CellTiter-Glo 3D, utilise les niveaux d’ATP comme déterminant de la viabilité cellulaire ^5,6. Bien que ce réactif soit utile pour les tests de paramètre, il existe plusieurs mises en garde, notamment l’impossibilité d’utiliser les échantillons à d’autres fins après la fin de l’essai.

L’imagerie des cellules vivantes est une forme sophistiquée de microscopie cinétique qui, lorsqu’elle est combinée à des réactifs fluorescents, a la capacité de quantifier une variété de lectures de la santé cellulaire dans des modèles PDO, y compris l’apoptose ^7,8,9 et la cytotoxicité¹⁰. En effet, l’imagerie de cellules vivantes a fait partie intégrante du criblage à haut débit de composés dans les plateformes 2D^11,12. Des systèmes tels que l’Incucyte ont rendu la technologie abordable et donc accessible aux groupes de recherche dans divers contextes. Cependant, l’application de ces systèmes pour analyser les cultures 3D en est encore à ses balbutiements.

Nous décrivons ici une méthode d’évaluation de la réponse aux médicaments dans des modèles PDO de cancer à l’aide de l’imagerie multiplexée de cellules vivantes (Figure 1). Grâce à l’analyse d’images en fond clair, les changements dans la taille et la morphologie des PDO peuvent être suivis cinétiquement. De plus, les processus cellulaires peuvent être quantifiés simultanément au fil du temps à l’aide de réactifs fluorescents, tels que le colorant rouge Annexine V pour l’apoptose et le colorant vert Cytotox pour la cytotoxicité. Les méthodes présentées sont optimisées pour le système d’imagerie de cellules vivantes Cytation 5, mais ce protocole peut être adapté à différentes plateformes d’imagerie de cellules vivantes.

Protocole

Les études utilisant des échantillons de tumeurs humaines ont été examinées et approuvées par le comité d’examen institutionnel (IRB) de l’Université de l’Iowa, protocole #201809807, et réalisées conformément aux normes éthiques énoncées dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets participant à l’étude. Les critères d’inclusion comprennent un diagnostic de cancer et la disponibilité d’échantillons tumoraux.

1. Placage d’AOP intactes dans une plaque à 96 puits

1. Préparez les réactifs.
   1. Préchauffer les plaques de 96 puits à 37 °C pendant la nuit et décongeler le BME pendant la nuit à 4 °C.
   2. Préparez un milieu de culture organoïde complet optimisé pour la culture du type de cancer d’intérêt. Les milieux de culture spécifiques utilisés pour les expériences présentées dans le présent document sont présentés dans le tableau supplémentaire 1.
      REMARQUE : Les composants du milieu peuvent avoir besoin d’être modifiés pour différents types de tumeurs. Par exemple, le milieu de culture organoïde est complété par de l’œstradiol 100 nM pour les tumeurs gynécologiques¹³. Le milieu préparé est stable à 4 °C pendant 1 mois. Pour un stockage à long terme, aliquoter le milieu dans des tubes de 50 mL et stocker à -20 °C.
2. Préparer deux aliquotes distinctes de milieux de culture organoïdes à 4 °C et 37 °C. Par exemple, si 60 puits sont plaqués dans une plaque de 96 puits, utilisez 6 mL de milieu de culture organoïde chaud et 150 μL de milieu de culture organoïde glacé.
3. Préparer le tampon de lavage des organoïdes : Compléter 1 PBS avec 10 mM HEPES, 1 x Glutamax, 5 mM EDTA et 10 μM Y-27632. Conserver à 4 °C
4. Récoltez les AOP cultivées dans une plaque de 24 puits. Effectuez toutes les étapes sur glace ou à 4 °C, sauf indication contraire.
   1. Aspirer le milieu de chaque puits à l’aide d’un système de conduite sous vide.
   2. Ajouter 500 μL de tampon de lavage organoïde glacé et pipeter doucement 2 à 3 fois à l’aide d’une pipette de 1000 μL. Incuber l’assiette sur de la glace pendant 10 min.
   3. Transférer le contenu de chaque puits dans un tube conique de 50 ml. Pour s’assurer que toutes les AOP sont en suspension, rincez chaque puits avec 300 μL supplémentaires de tampon de lavage organoïde et transférez-les dans le tube conique de 50 mL. Centrifuger pendant 5 min à 350 x g à 4 °C
   4. Aspirer le surnageant de la pastille BME/organoïde à l’aide d’un système de conduite sous vide, en laissant ~ 5 mL restant dans le tube. Ajouter 20 mL de tampon de lavage organoïde et remettre doucement la pastille en suspension à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Incuber sur glace pendant 10 min.
   5. Centrifuger pendant 5 min à 350 x g à 4 °C. Aspirer le surnageant avec un système de conduite à vide, en prenant soin de ne pas perturber la pastille de PDO.
5. Placage des AOP dans une plaque à 96 puits : Effectuer toutes les étapes sur la glace, sauf indication contraire.
   1. Remettre en suspension la pastille PDO dans une quantité appropriée de milieu de culture organoïde glacé pour créer une suspension PDO. Transférer la suspension PDO dans un tube de microcentrifugation glacé de 1,5 ml.
      REMARQUE : Pour calculer la quantité de milieux de culture organoïdes, déterminer le nombre de puits à plaquer dans une plaque de 96 puits, en tenant compte du fait que les PDO sont plaquées dans un dôme de 5 μL dans un rapport de 1:1 entre le milieu de culture organoïde et le BME. Par exemple, lors du placage d’une plaque de 96 puits et de l’utilisation uniquement des 60 puits intérieurs, la quantité totale de suspension PDO nécessaire sera de 300 μL : 150 μL de milieu de culture organoïde et 150 μL de BME. Pour les modèles qui présentent une croissance optimale à différents pourcentages d’EMO, le rapport entre l’EMI et le milieu peut être modifié à cette étape, bien qu’il soit important de normaliser le rapport pour tous les tests pour chaque modèle spécifique. Pour tenir compte de l’erreur de pipetage, ajoutez 10 % de volume à chaque composant.
   2. Comptez le nombre d’AOP.
      1. Transvaser 2,5 μL de suspension PDO dans un tube de microcentrifugation glacé de 1,5 mL et mélanger avec 2,5 μL de BME. Transférez le mélange de 5 μL sur une lame de microscope en verre propre. Ne pas couvrir la glissière. Le mélange se solidifiera en un dôme.
      2. Visualisez à l’aide d’un microscope à fond clair à 4x. Compter le nombre d’AOP dans le mélange de 5 μL ; l’objectif est d’avoir environ 25 à 50 PDO par dôme de 5 μL.
         REMARQUE : Si la densité désirée n’est pas atteinte dans le mélange d’essai, ajuster le volume final de la suspension d’AOP soit en ajoutant plus de milieu de culture organoïde, soit en centrifugeant la suspension d’AOP et en remettant en suspension la pastille d’AOP dans un volume plus faible de milieu de culture organoïde glacé. Quelle que soit la façon dont la suspension de la PDO est modifiée à cette étape, le rapport final BME :suspension PDO à l’étape 1.5.3. devrait être de 1:1.
   3. À l’aide d’une pipette de 200 μL avec des pointes à large diamètre, mélanger soigneusement la suspension PDO avec une quantité égale de BME pour obtenir un rapport de 1:1 entre le milieu de culture organoïde et le BME. Évitez les bulles, qui perturberont l’intégrité des dômes.
   4. À l’aide d’une pipette de 20 μL, ensemencez des dômes de 5 μL au centre de chaque puits d’une plaque préchauffée de 96 puits, en n’ensemenceant que les 60 puits intérieurs. Pour assurer une répartition égale des PDO, pipeter périodiquement le contenu du tube de 1,5 mL avec une pipette de 200 μL avec des pointes à large alésage.
   5. Une fois tous les puits ensemencés, placez le couvercle sur la plaque et retournez doucement. Incuber la plaque inversée à 37 °C pendant 20 min dans l’incubateur de culture tissulaire pour permettre aux dômes de se solidifier.
      REMARQUE : L’inversion de la plaque garantit que le dôme du milieu de culture BME/organoïde conserve la structure 3D pour fournir suffisamment d’espace pour la formation d’AOP.
   6. Retournez l’assiette pour qu’elle repose avec le couvercle vers le haut et incubez pendant 5 min à 37 °C.

2. Traitements et ajout de colorants fluorescents pour le multiplexage

1. Pendant que les dômes BME se solidifient dans les plaques à 96 puits, préparez des dilutions de réactifs d’imagerie fluorescents pour cellules vivantes. Les paramètres spécifiques pour le multiplexage du colorant rouge Annexine V et du colorant vert Cytotox sont donnés ici.
2. Préparation du réactif fluorescent (jour -1) : Calculer le volume approprié de milieu de culture organoïde en fonction du nombre de puits à traiter, en supposant que chaque puits sera traité avec 100 μL de milieu dosé avec un colorant. Diluer le colorant dans un milieu de culture organoïde préchauffé à la concentration désirée.
   REMARQUE : La quantité totale de milieux nécessaires varie en fonction de l’expérience. Ajoutez 10 % au volume final pour tenir compte de l’erreur de pipetage. Par exemple, pour traiter les 60 puits intérieurs d’une plaque de 96 puits, préparer 6,6 mL de milieu dosé au colorant (tableau 1).
3. Traiter chaque puits avec 100 μL de milieux de culture organoïdes dosés 2x colorants. Ajouter 200 μL de PBS stérile 1x dans les puits vides extérieurs de la plaque. Incuber à 37 °C pendant la nuit.
   REMARQUE : Le PBS dans les puits périphériques diminue l’évaporation du média des puits internes.
4. Ajout de médicaments/agents de traitement (jour 0) : Préparer les médicaments dans un milieu de culture organoïde préchauffé à une concentration de 2x dans un volume de 100 μL par puits.
   REMARQUE : Le DMSO peut être toxique pour les cellules à des concentrations élevées. Une concentration de 0,1 % de DMSO n’est pas dépassée dans les expériences réalisées dans cette étude. En plus des médicaments, certains réactifs fluorescents sont distribués sous forme de solution DMSO. Il est important de tenir compte de la concentration totale de DMSO lorsque vous travaillez avec de tels réactifs.
5. Ajouter 100 μL de 2 milieux dosés dans chaque puits ; Évitez de créer des bulles.

3. Configuration des paramètres d’imagerie

1. Placer l’assiette dans Cytation 5. Ouvrir Gen5. Cliquez sur Nouvelle tâche > mode manuel de l’imageur. Sélectionnez Capturer maintenant et entrez les paramètres suivants : Objectif (sélectionnez le grossissement souhaité) ; Filtre (sélectionnez la microplaque) ; Format de microplaque (sélectionnez le nombre de puits) ; et Type de navire (sélectionnez le type de plaque). Cliquez sur Utiliser le couvercle et Utiliser une vitesse de support plus lente. Cliquez sur OK.
   REMARQUE : Type de récipient : Soyez aussi précis que possible lors de la sélection des informations sur la plaque car le logiciel est calibré à la distance spécifique entre l’objectif et le bas de la plaque pour chaque type de plaque et épaisseur du plastique.
   Vitesse de support plus lente : Cochez cette case pour éviter de perturber les dômes lors du chargement/déchargement des plaques.
2. Créez une pile Z qui imagera l’ensemble du dôme BME.
   1. Sélectionnez un puits d’intérêt à afficher (panneau de gauche, sous l’histogramme).
   2. Sélectionnez le canal Fond clair (panneau de gauche, en haut). Cliquez sur Exposition automatique et ajustez les paramètres selon vos besoins.
   3. Définissez le bas et le haut de l’onglet Z-Stack : Expand Imaging Mode (panneau de gauche, au milieu). Cochez la case Z-Stack . À l’aide des flèches de réglage de trajectoire (panneau de gauche, au milieu), cliquez sur le réglage vers le bas jusqu’à ce que tous les PDO soient entrés puis flous et flous. Définissez-le comme le bas de la pile Z. Répétez dans la direction opposée en utilisant les flèches de réglage de cap pour définir le haut de la pile Z.
   4. Pour vous assurer que les paramètres de la pile Z sont appropriés pour d’autres puits d’intérêt, sélectionnez un autre puits (panneau de gauche, sous l’histogramme) et visualisez le haut et le bas de la pile en Z.
   5. Pour saisir manuellement les positions focales, cliquez sur les trois points à côté du réglage fin (panneau de gauche, en haut). Une fenêtre s’ouvrira ; saisissez la valeur de la pile Z supérieure (qui se trouve dans le panneau de gauche, au centre, sous Mode d’imagerie). Répétez l’opération pour la valeur inférieure de la pile Z. Ajustez si nécessaire pour capturer la plage Z souhaitée en répétant l’étape 3.2.3. Si des ajustements étaient nécessaires, sélectionnez un autre puits pour vérifier les paramètres.
3. Définissez les paramètres d’exposition pour le(s) canal(s) fluorescent(s). Les réglages sont décrits pour deux canaux fluorescents (GFP et TRITC). Le nombre spécifique de canaux fluorescents dépendra de l’expérience et des cubes fluorescents installés dans le système d’imagerie de cellules vivantes.
   REMARQUE : Si l’intensité du signal est prévue être significativement plus élevée à la fin de l’expérience, les utilisateurs doivent envisager d’effectuer des expériences d’essai pour déterminer les paramètres d’exposition optimaux à la fin de l’expérience qui peuvent ensuite être appliqués lors de la configuration des paramètres initiaux.
   1. Développez l’onglet Mode d’imagerie (panneau de gauche, au milieu) et ouvrez Modifier l’étape d’imagerie. Une fenêtre contextuelle apparaîtra.
   2. Sous Canaux, cliquez sur la bulle pour le nombre de canaux souhaité. Désignez un canal pour le fond clair et des canaux supplémentaires pour chaque canal fluorescent. Dans cet exemple, canal 1 = champ clair ; Canal 2 = GFP ; Canal 3 = TRITC. À l’aide des menus déroulants Couleur, sélectionnez le paramètre approprié pour chaque canal. Fermez la fenêtre d’édition en cliquant sur OK.
   3. Configurez chaque canal fluorescent.
      1. Basculez le canal sur GFP (panneau de gauche, en haut).
      2. Cliquez sur Exposition automatique (panneau de gauche, en haut). Développez l’onglet Exposition (panneau de gauche, au milieu) et ajustez les paramètres d’exposition pour minimiser le signal d’arrière-plan.
      3. Copiez les paramètres d’exposition dans l’onglet Mode d’image en suivant les étapes 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. Cliquez sur l’icône Copier à côté de la case Modifier l’étape d’imagerie . Cliquez sur Modifier l’étape d’imagerie, ce qui ouvrira une autre fenêtre.
      5. Sous le canal GFP, cliquez sur l’icône Presse-papiers dans la ligne Exposition pour ajouter les paramètres Éclairage, Temps d’intégration et Gain de la caméra au canal.
      6. Répétez les étapes 3.3.3.4 à 3.3.3.5 pour le canal TRITC. Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre.
4. Configurez les étapes de prétraitement d’image et de projection Z pour automatiser le prétraitement d’image.
   1. Cliquez sur l’icône Appareil photo (panneau de gauche, coin inférieur). Une nouvelle fenêtre s’ouvrira.
   2. Sous Ajouter une étape de traitement (panneau de gauche, en bas), cliquez sur Prétraitement de l’image. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira.
   3. Dans l’onglet Fond clair , désélectionnez Appliquer le prétraitement d’image.
   4. Pour chaque onglet Couche fluorescente , assurez-vous que l’option Appliquer le prétraitement de l’image est sélectionnée. Désélectionnez Utiliser les mêmes options que le canal 1 et cliquez sur OK. La fenêtre se fermera.
   5. Sous Ajouter une étape de traitement, cliquez sur Projection Z. Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Si vous le souhaitez, ajustez la plage de tranches (par exemple, pour réduire la plage Z). Fermez la fenêtre en sélectionnant OK.
5. Créer un protocole.
   1. Cliquez sur Visionneuse d’images dans la barre d’outils. Dans le menu déroulant, cliquez sur Créer une expérience à partir de cet ensemble d’images. La fenêtre d’imagerie se ferme et la fenêtre de procédure s’ouvre.
      REMARQUE : Les paramètres sélectionnés en mode manuel de l’imageur seront automatiquement chargés dans la nouvelle fenêtre, ce qui permettra de créer un protocole expérimental.
   2. Pour régler la température et le dégradé : Cliquez sur Régler la température sous l’en-tête Actions (à gauche). Une nouvelle fenêtre s’ouvrira. Sélectionnez Incubateur activé et entrez manuellement la température souhaitée sous Température. Ensuite, sous Dégradé, entrez manuellement 1. Fermez la fenêtre en sélectionnant OK.
      REMARQUE : La création d’un gradient de 1 °C empêchera la formation de condensation sur le couvercle de la plaque.
   3. Désignez des puits à l’image.
      1. Double-cliquez sur l’étape Image sous Description. Cliquez sur Plaque complète (coin droit, haut). Cela ouvrira la fenêtre Disposition de la plaque .
      2. Mettez en surbrillance les puits d’intérêt à l’aide du curseur. Cliquez sur OK. Si vous le souhaitez, cochez les cases Binning de la mise au point automatique et Binning de capture . Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre.
         REMARQUE : Le binning nécessitera un réglage de l’exposition, comme décrit à l’étape 3.3.3.2 ci-dessus. Veuillez vous référer à la section Discussion pour connaître les scénarios spécifiques dans lesquels cette fonctionnalité peut être utilisée.
   4. Définissez des intervalles pour l’imagerie cinétique.
      1. Cliquez sur Options sous l’en-tête Autre (à gauche). Cochez la case Procédure cinétique discontinue .
      2. Sous Durée totale estimée, saisissez la durée d’exécution de l’expérience (par exemple, 5 jours). Sous Intervalle estimé, entrez l’intervalle pour imager la plaque (par exemple, toutes les 6 h).
      3. Cliquez sur Pause après chaque exécution pour laisser le temps à la plaque d’être transférée dans l’incubateur. Fermez la fenêtre en sélectionnant OK.
   5. Mettre à jour les étapes de réduction des données.
      1. Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre Procédure. Un onglet s’ouvre pour mettre à jour les étapes de réduction des données. Sélectionnez Oui. Double-cliquez sur Prétraitement d’image. Cliquez sur les différents canaux pour vérifier les paramètres et cliquez sur OK.
      2. Double-cliquez sur Projection Z. Cliquez sur les différents canaux pour vérifier les paramètres. Cliquez sur OK. Cliquez ensuite à nouveau sur OK pour fermer la fenêtre Réduction des données.
   6. Formatez la disposition de la plaque.
      1. Ouvrez l’assistant de disposition de plaque et désignez les types de puits en suivant les étapes 3.6.2 à 3.6.3.
      2. Cliquez sur l’icône Disposition de plaque dans la barre d’outils (coin gauche, en haut) pour ouvrir l’assistant de disposition de plaque.
      3. Cochez les cases à côté des types de puits utilisés dans l’expérience. Sous Contrôles de dosage, entrez le nombre de types de contrôle différents à l’aide des flèches. Cliquez sur Suivant pour ouvrir la fenêtre Contrôle du test #1 .
      4. Définir les conditions du puits témoin d’essai en suivant les étapes 3.6.5 à 3.6.8.
      5. Dans la fenêtre Contrôle d’essai #1, entrez l’étiquette de contrôle dans la case ID de disposition de plaque . Si vous le souhaitez, entrez le nom complet dans la case adjacente. Sélectionnez le nombre de répétitions pour la condition de contrôle respective à l’aide des flèches.
      6. Si vous utilisez plusieurs concentrations ou une série de dilutions dans le contrôle, cliquez sur Définir les dilutions/concentrations et utilisez le menu déroulant pour sélectionner le type. Inscrivez les valeurs de chaque concentration/dilution dans le tableau.
         REMARQUE : La fonction automatique peut être utilisée si les concentrations changent par incréments constants.
      7. Sélectionnez l’onglet Couleur dans la barre d’outils. Choisissez la couleur de texte et la couleur d’arrière-plan souhaitées pour le contrôle dans le menu déroulant. Cliquez sur Suivant.
      8. Répétez si nécessaire avec des commandes supplémentaires.
      9. Définir les conditions du puits d’échantillonnage conformément aux 3.6.10 à 3.6.12.
      10. Sur la page Configuration de l’exemple , entrez le préfixe de l’ID de l’exemple (par exemple, SPL). Sélectionnez le nombre de répétitions à l’aide des flèches. Si vous utilisez des échantillons avec des concentrations de traitement variables, sélectionnez Concentrations ou Dilutions dans le menu déroulant Type . Entrez les dilutions/concentrations dans le tableau et entrez les unités dans la case Unité .
      11. Sélectionnez Champs d’identification dans la barre d’outils. Entrez le nom de la catégorie souhaitée (p. ex., ID de l’échantillon, médicament) dans le tableau.
      12. Sélectionnez l’onglet Couleur dans la barre d’outils. Sélectionnez une couleur différente pour chaque groupe de traitement/échantillon. Cliquez sur Terminer. Cela ouvrira la page Disposition de la plaque.
          REMARQUE : Les chiffres sur le côté gauche correspondent aux différents numéros d’échantillon.
      13. Attribuez des exemples d’ID en suivant les étapes 3.6.14 à 3.6.16.
      14. Choisir SPL1 dans le panneau de gauche. Utilisez le curseur pour sélectionner les puits.
          REMARQUE : Les outils de sélection automatique peuvent être ajustés dans la zone d’affectation en série. Le nombre de répétitions et l’orientation de la mise en page peuvent être prédéterminés.
      15. Répétez avec d’autres échantillons pour terminer la disposition de la plaque. Une fois satisfait, cliquez sur OK.
      16. Dans la barre d’outils Fichier , sélectionnez Exemples d’ID. Remplissez les colonnes ID de l’échantillon avec les informations appropriées pour chaque échantillon (par exemple, le type de médicament). Appuyez sur OK.
   7. Enregistrez le protocole.
      1. Dans la barre d’outils, cliquez sur Fichier > Enregistrer le protocole sous. Sélectionnez l’emplacement d’enregistrement du fichier. Entrez un nom de fichier. Cliquez sur Enregistrer pour fermer la fenêtre.
      2. Cliquez sur Fichier > Quitter dans la barre d’outils. Un onglet s’ouvrira pour enregistrer les modifications apportées au mode manuel de l’imageur. Sélectionnez Non.
      3. Un onglet s’ouvrira pour enregistrer les modifications apportées à l’expérience 1. Sélectionnez Non. Un onglet s’ouvre pour mettre à jour la définition du protocole. Sélectionnez Mettre à jour. Fermez le logiciel.
6. Importez le protocole dans BioSpa OnDemand et terminez la configuration de l’expérience.
   1. Ouvrez le logiciel BioSpa OnDemand (logiciel de planification).
   2. Sélectionnez un emplacement disponible dans le logiciel.
   3. Retirez la plaque du système d’imagerie de cellules vivantes. Cliquez sur Ouvrir le tiroir pour accéder à l’emplacement approprié dans le logiciel de planification et insérez la plaque. Cliquez sur Fermer le tiroir.
      REMARQUE : Cette étape peut être effectuée à tout moment une fois que le protocole a été créé à l’étape 3.5.7 ci-dessus. Cependant, la plaque doit être dans la Cytation 5 pour effectuer un essai de synchronisation à l’étape 3.6.4.3 ci-dessous.
   4. Importez le protocole.
      1. Sous l’onglet Informations sur la procédure , sélectionnez Utilisateur dans le menu déroulant. En regard de l’emplacement Protocole , cliquez sur Sélectionner > Ajouter une nouvelle entrée.
      2. À côté de l’emplacement Protocole, cliquez sur Sélectionner. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre pour naviguer vers le protocole souhaité dans l’architecture de fichiers. Cliquez sur Ouvrir pour importer le protocole dans le logiciel de planification.
      3. Entrez le temps nécessaire pour imager la plaque. Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre Liste des protocoles Gen5 .
         REMARQUE : Cette étape est particulièrement importante lorsque vous exécutez plusieurs tests à la fois. Pour déterminer le temps nécessaire à la création d’images, cliquez sur Effectuer une exécution de minutage maintenant. Cliquez sur OK.
   5. Définissez des intervalles d’imagerie et planifiez l’expérience.
      1. Sous Intervalle, entrez l’intervalle d’imagerie désigné à l’étape 3.5.4.
      2. Sous Options d’heure de début, sélectionnez Lorsque disponible. Sous Durée, sélectionnez Fixe ou Continu.
         REMARQUE : Une heure de début spécifique peut être désignée au lieu d’exécuter le protocole à la prochaine heure disponible. La sélection de Durée fixe définit un point de terminaison spécifique pour l’expérience et oblige l’utilisateur à désigner une période d’expérimentation. La durée continue permet à l’expérience de s’exécuter sans point de terminaison et ne peut être terminée que par un utilisateur qui arrête l’expérience.
      3. Cliquez sur Programmer la plaque/le récipient. Cela ouvrira la séquence de validation de la plaque. Un onglet s’ouvrira avec l’heure de première lecture proposée. Cliquez sur Oui pour accepter cette planification.

4. Analyse d’images dans le logiciel Gen5 (Figure 2)

1. Ouvrez le module Analyse d’images.
   1. Ouvrez Gen5. Dans le Gestionnaire des tâches, sélectionnez Expériences > Ouvrir. Sélectionnez le test pour ouvrir le fichier. Cliquez sur Vue > plaque dans la barre d’outils.
   2. Remplacez le menu déroulant Données par Projection Z. Double-cliquez sur un puits qui vous intéresse. Sélectionnez Analyser > je souhaite configurer une nouvelle étape de réduction des données d’analyse d’image. Cliquez sur OK.
2. Analyse cellulaire
   1. Masque primaire
      1. Sous Paramètres d’analyse, sélectionnez Type : Canal d’analyse et de détection cellulaire : ZProj[Tsf[Bright Field]] (panneau de gauche, au centre).
      2. Cliquez sur Options. Cela ouvrira la page Masque principal et nombre. Dans la zone Seuil , cochez Auto et cliquez sur Appliquer. Cliquez sur la zone Mettre en surbrillance les objets (panneau de droite, en bas) pour afficher les objets dans le seuil désigné. Ajustez si nécessaire pour inclure des objets d’intérêt.
         REMARQUE : les paramètres de seuil sont basés sur l’intensité des pixels. Par exemple, si le seuil est défini sur 5000, les pixels d’une intensité supérieure à 5000 seront inclus dans l’analyse.
      3. Sous Sélection d’objet, désignez la taille minimale et maximale de l’objet (μm). Ajustez si nécessaire pour exclure les débris cellulaires/cellules individuelles.
         REMARQUE : La taille de l’AOP peut varier considérablement entre les différents modèles et types. Utilisez l’outil de mesure du logiciel Gen5 pour déterminer les seuils de taille de PDO minimum et maximum pour chaque modèle. Les utilisateurs peuvent choisir un seuil de taille minimale de PDO plus petit par rapport à la valeur fournie par l’outil de mesure afin d’éviter l’exclusion de fragments de PDO à des moments ultérieurs après le traitement médicamenteux.
      4. Pour limiter l’analyse à une certaine région du puits, désélectionnez Analyser l’image entière et cliquez sur Bouchage. Dans la fenêtre Image Plug , utilisez le menu déroulant pour sélectionner Forme de plug . Ajustez les paramètres de taille et de position selon les besoins pour s’adapter à la région d’intérêt.
         REMARQUE : Il est important de maximiser le nombre de PDO dans la prise tout en excluant les zones sans PDO pour minimiser le bruit de fond. Désignez une taille de fiche qui capturera de manière cohérente la majorité des objets d’intérêt dans les répétitions. Il est important de générer un bouchon qui exclut également les bords du dôme car il exclut tous les objets qui peuvent sembler déformés en raison de la réfraction de la lumière de la courbure extrême du dôme autour des bords. Inclure les objets de bord principaux peut également être désélectionné pour capturer uniquement des PDO entiers dans la prise.
   2. Analyse des sous-populations. Un exemple de désignation de sous-population est fourni à la figure 3.
      1. Cliquez sur Mesures calculées dans la barre d’outils Analyse cellulaire. Cliquez sur Sélectionner ou créer des mesures d’intérêt au niveau de l’objet (coin droit, en bas). Sous Métriques d’objet disponible, sélectionnez les métriques d’intérêt (par exemple, circularité) et cliquez sur le bouton Insérer. Cliquez sur OK.
         REMARQUE : La morphologie et la densité de chaque modèle d’ODP détermineront les meilleurs paramètres d’intérêt pour distinguer la sous-population.
      2. Cliquez sur Analyse de sous-population dans la barre d’outils Analyse cellulaire . Cliquez sur Ajouter pour créer une nouvelle sous-population. Une fenêtre contextuelle s’ouvrira.
      3. Si vous le souhaitez, entrez un nom pour la sous-population. Sous Mesures d’objet, sélectionnez une mesure qui vous intéresse et appuyez sur Ajouter une condition. Dans la fenêtre Modifier la condition , entrez les paramètres de la mesure d’objet choisie. Répétez l’opération avec des mesures supplémentaires si nécessaire.
         REMARQUE : Les paramètres peuvent être ajustés manuellement ou réglés à l’aide de l’outil de recherche. Par exemple, pour exclure les débris, les utilisateurs peuvent ajouter Surface comme mesure d’objet et sélectionner des objets inférieurs à 800. La circularité en tant que métrique d’objet est couramment utilisée, et tous les objets dont la circularité est supérieure à 0,2-0,5 sont inclus, selon le modèle.
      4. Dans le tableau en bas de la fenêtre, cochez les résultats souhaités à afficher. Cliquez sur OK > Appliquer.
      5. Pour afficher les objets de la sous-population, utilisez le menu déroulant Détails de l’objet (panneau de droite, centre) pour sélectionner la sous-population. Les objets qui entrent dans les paramètres seront mis en évidence dans l’image.
         REMARQUE : pour modifier les couleurs de surbrillance du masque principal et de la sous-population, cliquez sur Paramètres (panneau de droite, en bas).
      6. Pour ajuster les paramètres de sous-population, rouvrez la fenêtre Analyse de sous-population à partir de la barre d’outils Analyse cellulaire . Sélectionnez la sous-population et cliquez sur Modifier. Cliquez sur Ajouter une étape.
         REMARQUE : Cela appliquera la même analyse à tous les puits de l’expérience à tous les points temporels. Dans le menu déroulant de la page Matrice, différentes mesures peuvent être sélectionnées pour une visualisation individuelle.

5. Exporter des données de Gen5 vers Excel

1. Pour personnaliser un fichier de données à exporter, sélectionnez l’icône Générateurs de rapports/exportations dans la barre d’outils. Dans la fenêtre contextuelle, cliquez sur Nouvelle exportation vers Excel.
2. Sur la page Propriétés de la fenêtre contextuelle, sélectionnez Portée > plaque et contenu > personnalisé. Cliquez sur l’option Contenu dans la barre d’outils. Cliquez sur Modifier le modèle, ce qui ouvrira le programme Excel.
3. Dans la feuille de calcul, sélectionnez Compléments > Tableau > Données de puits. Passez la souris sur les différentes sélections pour voir les options d’exportation. Sélectionnez la métrique d’intérêt (par exemple, Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
   REMARQUE : La disposition des plaques peut être ajoutée au modèle d’analyse de feuille de calcul en sélectionnant Compléments > Résumé > disposition du protocole.
4. Une fenêtre d’édition s’ouvre. Dans la zone Wells , désignez les puits à exporter par Well-ID ou Well #. Sélectionnez OK. Un modèle sera chargé dans le fichier de feuille de calcul. Fermez la feuille de calcul. Le modèle est automatiquement enregistré.
5. Cliquez sur OK dans la fenêtre Nouvelle exportation vers Excel et fermez la fenêtre Générateurs de rapports/exportations .
6. Cliquez sur l’icône Exporter dans la barre d’outils Gen5. Cochez la case à côté du fichier d’exportation souhaité. Cliquez sur OK. Gen5 remplira automatiquement le modèle de feuille de calcul et ouvrira le fichier dans Excel.

6. Analyse des données externes

1. Ouvrez le fichier d’exportation (.xlsx) dans Excel.
2. Pour chaque puits, divisez chaque valeur individuelle par la valeur de 0:00 pour ce puits. Cela définira le point de temps 0 égal à 1, et chaque valeur au-delà sera relative à la lecture initiale.
3. Ouvrez un nouveau fichier dans le logiciel d’analyse de données. Sélectionnez l’option de mise en page XY .
   REMARQUE : Dans ce protocole, GraphPad Prism (version 9.5.1) a été utilisé.
4. Étiquettes d’entrée pour chaque groupe de données. Copiez et collez les points temporels et les valeurs normalisées correspondantes pour chaque groupe de traitement dans la table Prism. Un graphique pour les données sera automatiquement généré et se trouve sous Graphiques.

Résultats

Notre objectif était de démontrer la faisabilité de l’utilisation de l’imagerie multiplexée de cellules vivantes pour évaluer la réponse thérapeutique de la PDO. Des expériences de preuve de concept ont été réalisées dans deux modèles PDO distincts de cancer de l’endomètre : ONC-10817 et ONC-10811 (voir la figure supplémentaire 1 et la figure supplémentaire 2 pour les données ONC-10811). L’apoptose (coloration à l’annexine V) et la cytotoxicité (absorption de...

Discussion

Les cultures PDO deviennent un système modèle in vitro de plus en plus populaire en raison de leur capacité à refléter les réponses et les comportements cellulaires². Des progrès significatifs ont été réalisés dans les techniques de génération, de culture et d’expansion des AOP, mais les méthodes d’analyse des réponses thérapeutiques ont pris du retard. Les kits de viabilité 3D disponibles dans le commerce sont des tests lytiques de fin d’évaluation, qui ne disposent pas de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)