Test non invasif pour la détermination de la cinétique de biosynthèse de la chlorophylle au cours des premiers stades de la désétiolement d’Arabidopsis

Résumé

Nous décrivons ici un outil avancé conçu pour le suivi de la biosynthèse de la chlorophylle au cours des premiers stades de la désétiolement des plantules d’Arabidopsis . La nouvelle méthodologie fournit une imagerie non invasive de fluorescence de la chlorophylle en temps réel à haute résolution spatiale et temporelle.

Résumé

La biosynthèse de la chlorophylle est une caractéristique de la désétiolement, l’une des étapes les plus dramatiques du cycle de vie des plantes. Le processus étroitement contrôlé et hautement dynamique de la biosynthèse de la chlorophylle est déclenché lors du passage de l’obscurité à la lumière chez les plantes à fleurs. Au moment où les plantules étiolées sont exposées aux premières traces de lumière du soleil, la conversion rapide (en quelques secondes) du protochlorophyllide en chlorophyllide est médiée par des complexes protéiques uniques acceptant la lumière, conduisant via des étapes métaboliques ultérieures à la production de chlorophylle pleinement fonctionnelle. Les techniques standard d’analyse de la teneur en chlorophylle comprennent l’extraction de pigments à partir de tissus végétaux détachés, ce qui ne s’applique pas à l’étude de processus aussi rapides. Pour étudier la cinétique de la chlorophylle in vivo avec une grande précision et une résolution spatio-temporelle dans les premières heures après la désétiolement induite par la lumière, un instrument et un protocole ont été développés. Nous présentons ici une procédure détaillée conçue pour une quantification statistiquement robuste de la chlorophylle dans les premiers stades de la désétiolement d’Arabidopsis .

Introduction

La désétiolation représente la phase la plus spectaculaire du cycle de vie des plantes, caractérisée par un certain nombre de changements morphologiques et un réarrangement complet du métabolisme des plantes (d’hétérotropique à autotropique)¹. La biosynthèse de la chlorophylle est une caractéristique de la désétioleation induite par la lumière chez les plantes et un processus très dynamique. La formation de chlorophylle à partir de protochlorophyllide précurseur produit à l’obscurité doit être étroitement coordonnée pour éviter les dommages dus aux sous-produits réactifs². La réduction des protochlorophyllides en chlorop....

Protocole

1. Préparation moyenne

1. Préparer le milieu de culture en mélangeant 0,75 g d’agent gélifiant avec 50 mL d’eau désionisée stérile dans une bouteille en verre pour obtenir une concentration de 1,5 % (p/v) pour une plaque de Petri (120 x 120 x 17 mm). Secouez doucement le mélange puis faites-le chauffer au micro-ondes jusqu’à ébullition pour dissoudre le gélifiant (la solution devient claire).
2. Laissez le fluide refroidir à 58-60 °C avant de passer aux étapes suivantes. Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination.
3. Ut....

Discussion

Étapes critiques du protocole et du dépannage - pas de lumière et prendre soin du masque
Comme le souligne directement la description du protocole ci-dessus, il est d’une importance cruciale d’éviter même les traces de lumière pendant la culture des semis de plantes étiolées ou juste avant de commencer le protocole¹¹. Dans notre installation, nous utilisons une chambre noire dédiée située dans le phytotron et séparée du reste du phytotron par une porte rotative.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzylaminopurine	Duchefa Biochemie	B0904.0001
Aluminum foil	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds	NASC collection	N1092
Cultivation chamber	PSI		custom made
Dimethilsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL)	Merck	EP3123000063
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101
iReenCAM device	PSI		custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL	Merck	Z305170-10EA
Laminar-flow box	UniGreenScheme	ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch	3M Science. Applied to Life	7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND	Merck	BR780546-500EA
Micropore tape	3M Science. Applied to Life	7100225115
Osram lumilux green l18w/66	Ovalamp	200008833
Petri plates - Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented	Merck	Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen	Merck	AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software	PSI		delivered as a part of the iReenCAM