Dispositif microfluidique bicouche pour la production de bouchons combinatoires

Résumé

La fabrication d’un dispositif bicouche à base de polydiméthylsiloxane (PDMS) pour la production de banques combinatoires dans des émulsions eau-dans-huile (bouchons) est présentée ici. Le matériel et les logiciels nécessaires à l’automatisation de la production de bougies sont détaillés dans le protocole, et la production d’une bibliothèque quantitative de bougies fluorescentes est également démontrée.

Résumé

La microfluidique des gouttelettes est un outil polyvalent qui permet l’exécution d’un grand nombre de réactions dans des compartiments de nanolitres chimiquement distincts. De tels systèmes ont été utilisés pour encapsuler une variété de réactions biochimiques - de l’incubation de cellules uniques à la mise en œuvre de réactions PCR, de la génomique à la synthèse chimique. Le couplage des canaux microfluidiques avec des vannes de régulation permet de contrôler leur ouverture et leur fermeture, permettant ainsi la production rapide de bibliothèques combinatoires à grande échelle composées d’une population de gouttelettes aux compositions uniques. Dans cet article, des protocoles pour la fabrication et le fonctionnement d’un dispositif microfluidique bicouche basé sur PDMS entraîné par pression qui peut être utilisé pour générer des bibliothèques combinatoires d’émulsions d’eau dans l’huile appelées bouchons sont présentés. En incorporant des programmes logiciels et du matériel microfluidique, l’écoulement des fluides souhaités dans le dispositif peut être contrôlé et manipulé pour générer des bibliothèques de bouchons combinatoires et pour contrôler la composition et la quantité de populations de bouchons constitutifs. Ces protocoles accéléreront le processus de génération de cribles combinatoires, en particulier pour étudier la réponse aux médicaments dans les cellules à partir de biopsies de patients cancéreux.

Introduction

La microfluidique permet de manipuler de petites quantités de fluides dans les microcanaux¹. L’échelle de fonctionnement des dispositifs microfluidiques typiques est de quelques dizaines à centaines de micromètres, ce qui permet de miniaturiser les réactions chimiques et biologiques, permettant ainsi de réaliser de telles réactions avec des quantités relativement faibles de réactifs. Initialement, les dispositifs microfluidiques étaient fabriqués avec des matériaux tels que le silicium² et le verre³. Bien qu’ils soient toujours utilisés⁴, ils posent certains problèmes, tels que la compatibilité avec les solvants, le coût de fabrication élevé et les difficultés d’intégration des contrôles pour l’écoulement des fluides ^5,6. Les méthodologies de fabrication basées sur le PDMS, appelées lithographie douce, offrent une alternative peu coûteuse pour le prototypage rapide de dispositifs⁷ et un moyen de fabriquer des dispositifs multicouches complexes⁸. L’ajout de vannes et de pompes aux dispositifs PDMS permet de contrôler l’acheminement et la vitesse des fluides dans les appareils ^9,10. Plusieurs méthodes ont été mises au point pour concevoir et actionner des microvannes de manière réversible ou irréversible - par exemple, des vannes bimétalliques en silicium et en aluminium, qui sont actionnées thermiquement¹¹ ou qui utilisent un gaz généré par une réaction électrochimique pour dévier une membrane en nitrure de silicium¹². Gu et al. démontrent l’utilisation des broches mécaniques d’un afficheur braille pour appliquer une pression sur des microcanaux afin de réguler le débit¹³. Un ensemble de microvannes qui a gagné en popularité est celui des vannes pneumatiques basées sur PDMS mises au point par le groupe de Stephen Quake¹⁴. En règle générale, ces vannes sont composées de deux microcanaux orthogonaux - un canal d’écoulement et un canal de contrôle. Lors de la pressurisation du canal de commande, une fine membrane PDMS dévie sur le canal d’écoulement, le fermant et interrompant ainsi l’écoulement du fluide. Une fois dépressurisée, la membrane se détend, ouvrant ainsi le canal d’écoulement et permettant la reprise de l’écoulement du fluide. Les vannes PDMS permettent ainsi de réguler le débit de manière robuste et réversible puisque le canal de commande peut être pressurisé et dépressurisé plusieurs fois¹⁵. De plus, comme ces vannes peuvent être actionnées par l’application d’une pression, elles ouvrent des voies pour le contrôle numérique et l’automatisation¹⁶. De plus, comme ils sont faits du même matériau, ils peuvent être intégrés de manière transparente dans la fabrication de dispositifs basés sur PDMS à l’aide de techniques de lithographie douce ^8,17,18. Ces caractéristiques font des vannes PDMS un choix attrayant pour la régulation du débit dans les dispositifs microfluidiques. Thorsen et al. ont utilisé le principe de ces vannes pour concevoir un multiplexeur fluidique - un réseau combinatoire de vannes pneumatiques - pour traiter près d’un millier de canaux d’écoulement d’entrée avec vingt canaux de contrôle¹⁹. Ce principe a été étendu pour acheminer sélectivement les fluides vers des chimiostats microfluidiques sur puce, de sorte que des réactions uniques puissent être effectuées simultanément dans chaque réacteur 20,21,22,23. Cependant, ces microréacteurs, bien qu’utiles pour optimiser l’utilisation de réactifs limités, ne peuvent pas paralléliser plusieurs réactions et ne sont pas suffisants pour les études à haut débit.

La microfluidique des gouttelettes est une sous-catégorie de la microfluidique qui implique la production de gouttelettes par la manipulation d’un écoulement de liquide multiphasique non miscible dans des dispositifs microfluidiques²⁴. La formation de gouttelettes implique la rupture d’un fluide continu par l’introduction d’un fluide non miscible, entraînant un pincement dû à l’instabilité de l’énergie interfaciale et à la formation d’une émulsion²⁵. Les tensioactifs aident à la formation de gouttelettes arrondies lorsque les émulsions quittent le microcanal en stabilisant les énergies interfaciales²⁶. Les gouttelettes plus grosses, appelées bouchons, sont moins stables et peuvent être collectées dans un compartiment de rétention (comme une longueur de tuyau) sous la forme d’un ensemble de compartiments aqueux espacés de chaque côté par un ou plusieurs liquides non miscibles²⁷. En plus de la miniaturisation et de la compartimentation, la microfluidique des gouttelettes offre également un débit accru de réactions biologiques, car un grand nombre de gouttelettes monodispersées peuvent être produites - chacune servant de nanoréacteur²⁸. Les gouttelettes, une fois générées, peuvent également être soumises à d’autres manipulations, telles que la division^29,30, la fusion^31,32, le tri^33,34 et l’assemblage en structures d’ordre supérieur^35,36. La microfluidique des gouttelettes a révolutionné plusieurs domaines scientifiques et technologies - de la PCR³⁷ à la transcriptomique unicellulaire³⁸, de la découverte de médicaments^39,40 à la virologie⁴¹, du séquençage de nouvelle génération⁴² à la synthèse chimique⁴³.

L’intégration de la lithographie douce et des microvannes basées sur le PDMS avec la technologie des gouttelettes est une combinaison puissante qui permet de réguler l’écoulement des fluides dans les microcanaux et de contrôler ultérieurement le contenu des gouttelettes. En fonction de l’ouverture et de la fermeture des canaux, il est possible de produire des populations distinctes de gouttelettes, chacune ayant une composition spécifique. Une telle plate-forme pourrait miniaturiser, compartimenter et paralléliser les réactions biochimiques et donc constituer une technique utile pour le criblage combinatoire⁴⁴. Le criblage combinatoire est une méthode à haut débit permettant de générer des dizaines de milliers de combinaisons de réactifs sélectionnés pour produire des banques composées de populations individuelles de composition connue. Le criblage combinatoire a été utilisé pour découvrir les effets synergiques entre les médicaments et les antibiotiques pour l’inhibition de la croissance bactérienne⁴⁵. Dans le domaine de la thérapie du cancer, le dépistage combinatoire a été utilisé pour tester des combinaisons de médicaments anticancéreux chez un patient donné, faisant ainsi progresser la thérapie personnalisée^46,47. Mathur et al. se sont appuyés sur cette technologie en intégrant une approche combinatoire de codage à barres de l’ADN pour évaluer les changements de transcriptome dans le criblage de médicaments à haut débit⁴⁸. Ainsi, le criblage combinatoire est une technologie puissante mais naissante, et il est nécessaire de développer diverses technologies microfluidiques pour exécuter et faciliter de telles procédures de dépistage.

L’objectif de ce manuscrit est de présenter un ensemble complet de protocoles pour la fabrication d’un dispositif microfluidique bicouche capable de générer une bibliothèque combinatoire de bouchons d’eau dans l’huile et de décrire le matériel et les logiciels nécessaires au fonctionnement d’un tel dispositif. Le débit de fluide est régulé à l’aide de vannes pneumatiques basées sur PDMS contrôlées par pression, qui sont à leur tour contrôlées par un programme LabVIEW personnalisé. Le débit des réactifs dans l’appareil est réalisé à l’aide de pompes à pression disponibles dans le commerce. Un prototype à huit entrées est présenté dans lequel un bouchon est formé par le contenu de trois entrées, chacune contenant un réactif aqueux. La phase aqueuse rencontre une phase huileuse continue, et les bouchons sont produits à une jonction en T avec une fréquence de 0,33 Hz. Le fonctionnement du système est démontré par la production d’une bibliothèque quantitative contenant trois populations distinctes de bouchons fluorescents. Cette technologie et cet ensemble de protocoles contribueront à accélérer la production de banques combinatoires à des fins de criblage à haut débit.

Protocole

1. Lithographie douce

REMARQUE : Le dispositif microfluidique est composé de deux couches, la couche d’écoulement et la couche de contrôle (Figure 1A), et chaque couche est moulée à partir de plaquettes à motifs individuels à l’aide d’une résine photosensible positive et négative respectivement (reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur la résine photosensible et les révélateurs).

1. Effectuez la fabrication de plaquettes pour la couche d’écoulement comme décrit ci-dessous.
   1. Déshydrater une plaquette de silicium (100 mm de diamètre, orientation <1-0-0>, 525) pendant la nuit (12-16 h) à 250 °C.
   2. Laissez refroidir la gaufrette avant de procéder à l’enrobage par centrifugation. Appliquez 3 à 4 ml de résine photosensible positive au centre de la plaquette.
   3. Rotation pendant 40 s à 1400 tr/min (344 tr/min) pour obtenir une hauteur de caractéristique de 45 μm.
   4. Cuisson molle sur plaque chauffante à l’aide d’une rampe de température, augmentant à raison de 450 °C /h, de 35 °C à 105 °C. Cette étape peut également être effectuée sur des tissus en microfibres pour éviter le contact direct et minimiser le bouillonnement de la résine photosensible. Retirez la plaquette de la plaque chauffante et laissez-la refroidir sur des mouchoirs en microfibre.
   5. Placez le photomasque (produit dans le commerce) correspondant à la couche d’écoulement (côté émulsion vers le bas) sur la plaquette de silicium recouverte d’une réserve et exposez-la sous une lampe UV, à 10 mW/cm², jusqu’à ce qu’une exposition totale de 200 mJ/cm² soit atteinte.
   6. Utilisez deux plaques de cuisson - l’une à 65 °C et l’autre à 95 °C - pour effectuer une cuisson post-exposition - pendant 1 min et 7 min respectivement - sur les plaques.
   7. Développez la plaquette en la transférant dans une boîte de Pétri remplie de révélateur pour photorésine positive. Agitez la boîte de Pétri en la secouant sur un agitateur de paillasse avec la plaquette complètement immergée et actualisez périodiquement la solution de développement jusqu’à ce que la plaquette soit complètement développée et que les caractéristiques soient clairement visibles.
   8. Utilisez de l’eau déminéralisée pour rincer le résidu de la plaquette et vérifiez au microscope stéréoscopique s’il y a des résidus à l’intérieur des canaux. Éliminez les résidus en remettant la plaquette dans la solution de révélateur ou en ajoutant soigneusement le révélateur à la plaquette à l’aide d’une micropipette. Une fois terminé, séchez la plaquette à l’aide d’un pistolet à pulvérisation d’azote.
   9. Reversez la plaquette en la plaçant sur une plaque chauffante réglée à 110 °C pendant 25 min. Ce processus permet d’obtenir des caractéristiques arrondies.
   10. Procédez à la silanisation de la plaquette comme indiqué à l’étape 1.3.
       REMARQUE : Le dépôt en phase vapeur d’hexaméthyldisilazane (HMDS) peut également être effectué sur les plaquettes de silicium avant l’application de la réserve afin d’améliorer l’adhérence entre la résine et la plaquette.
2. Effectuez la fabrication de plaquettes pour la couche de contrôle comme décrit ci-dessous.
   1. Prenez une autre plaquette de silicium et déshydratez-la en la plaçant sur une plaque chauffante réglée à 110 °C pendant 15 min.
   2. Retirez la plaquette et laissez-la refroidir à température ambiante avant de procéder à l’enrobage par centrifugation.
   3. Appliquez 5 ml de résine photosensible négative au centre de la plaquette.
   4. Utilisez le protocole de spin suivant pour obtenir une hauteur de caractéristique de 40 μm : 5 s à 500 tr/min (accélération de 100 tr/min), 33 s à 1400 tr/min (300 tr/min), et enfin décélérer à 0 tr/min pendant 5 s à 300 tr/min.
   5. Cuire à l’aide de deux plaques de cuisson séparées réglées à 65 °C et 95 °C pendant 1 min et 15 min respectivement. Retirez la plaquette de la plaque chauffante et laissez-la refroidir sur des mouchoirs en microfibre.
   6. Placez le photomasque (produit dans le commerce) correspondant à la couche témoin (côté émulsion vers le bas) sur la plaquette recouverte d’une résine et exposez la plaquette sous une lampe UV, réglée à 15 mW/cm², jusqu’à ce qu’une exposition totale de 250 mJ/cm² soit atteinte.
   7. Utilisez deux plaques de cuisson - l’une à 65 °C et l’autre à 95 °C - et effectuez une cuisson post-exposition de la gaufrette pendant 2 min puis 5 min respectivement. Retirez la plaquette de la plaque chauffante et laissez-la refroidir sur des mouchoirs en microfibre.
   8. Développez la plaquette en la transférant dans une boîte de Pétri remplie de révélateur pour photorésine négative pendant 4 min. Actualisez le développeur et continuez le processus pendant 4 minutes de plus.
   9. Rincez la plaquette avec de l’isopropanol pour éliminer la résine photosensible résiduelle et utilisez un stéréomicroscope pour vérifier que la plaquette ne contient pas de résidu à l’intérieur des canaux.
   10. Éliminez les résidus en remettant la plaquette dans la solution de révélateur ou en ajoutant soigneusement le révélateur à la plaquette à l’aide d’une micropipette. Une fois terminé, séchez la plaquette à l’aide d’un pistolet à pulvérisation d’azote.
   11. Une fois complètement développé, faites cuire la résine photosensible en plaçant la plaquette sur une plaque chauffante réglée à 95 °C pendant 10 min.
   12. Procédez à la silanisation comme indiqué à l’étape 1.3.
3. Effectuez la silanisation comme décrit ci-dessous.
   1. Placez la gaufrette dans un dessiccateur. Placez une bouteille en verre dans le dessiccateur et ajoutez 4 à 5 gouttes de 1,1,3,3 tétraméthyldisiloxane.
      ATTENTION : Le 1,1,3,3-tétraméthyldisiloxane n’est pas toxique mais est inflammable. D’autres silanes peuvent être utilisés, mais ils peuvent être toxiques. Il est recommandé d’effectuer la silanisation dans une hotte tout en portant l’équipement de protection individuelle (EPI) nécessaire tel qu’une blouse de laboratoire, des lunettes et des gants en nitrile.
   2. Tirez le vide pendant 15 min et scellez le dessiccateur pendant 12-16 h pour permettre au silane de se déposer sur la plaquette.
   3. Ouvrez le dessiccateur et jetez la bouteille en verre. Placez la gaufrette dans une boîte de Pétri propre.
4. Effectuez la fabrication d’un dispositif microfluidique comme décrit ci-dessous.
   REMARQUE : Le protocole suivant a été adapté des œuvres précédentes²³.
   1. Préparez deux solutions PDMS distinctes : l’une pour la couche d’écoulement et l’autre pour la couche de contrôle. Pour chaque solution, mélangez l’agent de base et l’agent de durcissement du kit PDMS dans un bécher et remuez à l’aide d’une tige de mélange. La couche témoin nécessite 10 g d’agent de base et 0,5 g d’agent de durcissement (rapport 20:1), tandis que la couche d’écoulement nécessite 40 g d’agent de base et 8 g d’agent de durcissement (rapport 5:1).
   2. Dégazer les solutions PDMS dans un dessiccateur jusqu’à ce qu’elles soient exemptes de gaz.
   3. Placez la plaquette d’écoulement silanisée dans une boîte de Pétri recouverte d’une feuille d’aluminium et versez la solution PDMS correspondante sur la plaquette. Remettez la boîte de Pétri dans le dessiccateur et tirez le vide pour dégazer davantage (pendant environ 20 min).
   4. Enrobez par centrifugation la plaquette de la couche témoin silanisée avec sa solution PDMS correspondante. Verser 3 à 4 ml de la solution au centre de la plaquette et faire tourner pendant 20 s à 1500 tr/min à 408 tr/min/s. Placez la gaufrette sur une surface plane dans une boîte de Pétri fermée pendant 20 minutes.
   5. Placez les couches d’écoulement et de contrôle dans un four à 80 °C pendant 18 à 20 min. Surveillez périodiquement les deux couches pour vérifier si elles sont durcies. Les couches sont prêtes lorsqu’elles sont suffisamment dures pour être malléables mais légèrement collantes, car cela améliore la liaison entre les deux couches.
   6. Découpez le PDMS autour de chacun des dispositifs de la plaquette de couche d’écoulement à l’aide d’un scalpel. Assurez-vous de ne pas couper trop près des éléments et de laisser environ 2 cm d’espace entre l’élément et les bords du PDMS. Une fois détaché de la plaquette de silicium, couvrez le bloc PDMS avec du ruban adhésif sur le côté de la fonction pour éviter toute contamination par la poussière.
   7. Une fois que tous les blocs PDMS ont été découpés, placez-les un par un sur la plaquette de couche de contrôle correspondante en effectuant un alignement approximatif à l’œil nu.
   8. Une fois que tous les blocs ont été placés sur leurs zones correspondantes sur la couche de contrôle, ajustez la position de chacun des blocs de sorte que les vannes de régulation se chevauchent sur les canaux d’écoulement correspondants pour terminer l’alignement. Cela peut également être réalisé à l’aide d’un stéréomicroscope.
   9. Éliminez les poches d’air entre les deux couches en appliquant une pression. Si la poche d’air se trouve sur ou à proximité d’une caractéristique, veillez à ne pas replier les canaux lors de l’application de la pression.
   10. Placez les appareils dans le four à 80 °C et laissez-les se coller pendant 12 à 16 h. Placez des poids de 100 g sur chacun des appareils pour améliorer la liaison entre les deux couches.
   11. Retirez la plaquette et découpez chaque appareil individuel. Décollez les appareils de la plaquette de la couche de contrôle et recouvrez le côté caractéristique avec du ruban adhésif.
   12. Placez chaque dispositif individuel sur un tapis de découpe avec le côté caractéristique vers le haut et percez un trou pour chacune des huit entrées de couche d’écoulement, huit entrées de canal de couche de contrôle, les entrées d’huile et la sortie à l’aide d’un poinçon de biopsie de 0,75 mm avec le côté caractéristique vers le haut.
   13. Chargez l’asher plasma à l’aide d’une lame de microscope et d’un seul appareil avec le ruban retiré et le côté de la caractéristique vers le haut. Effectuez l’incinération au plasma d’oxygène d’une puissance de 30 W pendant une durée de 20 s.
   14. Retirez l’appareil et la glissière en verre dès que l’incinération est terminée et placez l’appareil avec le côté caractéristique vers le bas sur la lame. L’adhérence entre le PDMS et le verre doit être immédiatement visible à l’œil nu. Appliquez une pression sur toutes les régions avec des poches d’air pour évacuer l’air.
   15. Placez les appareils sur une plaque chauffante réglée à 110 °C pendant 60 min avec un poids sur le dessus pour améliorer l’adhérence du PDMS au verre.

2. Configuration matérielle

REMARQUE : La figure 1B montre un schéma des connexions au dispositif microfluidique et la figure 2 montre la réalisation d’un tel schéma à l’aide du matériel nécessaire.

1. Configurez les vannes pneumatiques comme décrit ci-dessous.
   REMARQUE : Chaque canal de commande, qui régule une vanne PDMS sur la puce, est à son tour contrôlé par une seule électrovanne. Le prototype présenté ici se compose de huit canaux de commande (figure 1A), et donc huit électrovannes sont nécessaires.
   1. Les électrovannes sont contrôlées à l’aide d’un logiciel LabVIEW personnalisé (Main Interface Program ; Figure 3 et Fichier supplémentaire 1, Fichier supplémentaire 2, Fichier supplémentaire 3, Fichier supplémentaire 4). Ce programme envoie des commandes MODBUS via une connexion TCP (Fichier supplémentaire 5, Fichier supplémentaire 6), à un contrôleur WAGO. Connectez le périphérique WAGO à l’ordinateur à l’aide du programme LabVIEW à l’aide d’un câble Ethernet. Procédez au raccordement séquentiel des électrovannes aux ports du contrôleur WAGO. Pour une description plus détaillée, veuillez vous référer aux protocoles²³ décrits précédemment.
   2. Connectez le réseau d’électrovannes à une source d’air comprimé à l’aide d’un tube de 1/4 po et réglez la pression du réseau de vannes à 3,5 bars. Dans ce système, les huit soupapes marquées 9-16 étaient utilisées.
2. Configurez les régulateurs de pression comme décrit ci-dessous.
   REMARQUE : une pompe à pression disponible dans le commerce est utilisée pour contrôler le débit du fluide (Figure 2). Un ensemble de pompes à huit orifices et à quatre orifices a été utilisé pour accueillir huit entrées aqueuses et deux entrées d’huile dans l’appareil. La pression de chaque port est régulée par un logiciel fourni par les fabricants.
   1. Raccordez la pompe à pression à une source d’air comprimé en veillant à ce que la pression fournie ne dépasse pas la pression maximale autorisée par la pompe (2,2 bars pour les contrôleurs à huit et à quatre ports).
   2. Connectez les pompes à pression à un ordinateur à l’aide d’un connecteur USB.
   3. Une fois les pompes mises en marche, elles doivent être visibles dans le logiciel correspondant. Réglez les pressions à zéro lors de la configuration des pompes.
   4. Connectez un connecteur Luer mâle à un connecteur cannelé de 3/32 po à chacun des 12 ports de sortie Luer Lock femelles des contrôleurs.
   5. Connectez un morceau de tube souple (OD : 3 mm, ID : 1 mm, L : 15 cm) à l’ardillon. Connectez un autre luer mâle à un connecteur cannelé de 3/32 po à l’autre extrémité du tube souple.
   6. Connectez un embout Luer (23 G, 0,5 po) au connecteur cannelé. À ce stade, le régulateur de pression est configuré et prêt à être utilisé.

3. Configuration du dispositif microfluidique

1. Connectez la tubulure du canal de commande comme décrit ci-dessous (Figure 2).
   1. Pour chaque canal de contrôle, coupez une longueur de tube en polytétrafluoroéthylène (PTFE) (OD : 0,042 po, ID : 0,022 po). Insérez la goupille d’un bout de luer de 23 G, 0,5 po à une extrémité.
   2. Connectez le bout de luer à un connecteur en nylon barbelé de 3/32 po de luer à un luer mâle. Insérez l’ardillon du connecteur dans une longueur de tube en polyuréthane (OD : 4 mm, ID : 2,5 mm). Connectez l’autre extrémité du tube en polyuréthane directement à une électrovanne.
   3. Remplissez une seringue d’eau et connectez un bout de luer de 23 G, 0,5 po à la fin.
   4. Connectez l’extrémité libre du tube en PTFE à cette seringue et injectez de l’eau jusqu’à environ la moitié du tube.
   5. Débranchez le tube de la seringue et insérez l’extrémité libre du tube dans un trou perforé du canal de commande correspondant (Figure 1A-C _1-8). Répétez l’opération jusqu’à ce que chaque canal de commande ait été connecté à l’électrovanne correspondante.
      REMARQUE : Dans cet article, les électrovannes 9-16 ont été connectées aux canaux de commande correspondant respectivement à C₁ à C₈ . Bien que ceux-ci puissent être connectés de n’importe quelle manière, il est important de se souvenir de l’ordre et de la séquence des connexions, en particulier lors de l’utilisation du programme d’interface principale.
   6. Utilisez le programme d’interface principale (Figure 3) pour ouvrir toutes les électrovannes (Mettre sous pression tous les canaux de commande). Cela poussera le fluide du tube dans les canaux de contrôle du dispositif microfluidique et le remplira ainsi. La figure 4 montre un exemple de vannes pressurisées et dépressurisées.
2. Connectez les réactifs et amorcez l’appareil comme décrit ci-dessous.
   1. Assurez-vous que tous les canaux de commande sont pressurisés en appuyant sur le bouton Pressuriser tous les canaux de commande du programme Main Interface (Figure 3).
   2. Pour chacun des réactifs aqueux, coupez un segment de tube en PTFE (diamètre extérieur : 0,042 po, diamètre intérieur : 0,022 po) suffisamment long pour connecter les pompes aux entrées des entrées du dispositif microfluidique. Connectez l’un des tubes au bout Luer à partir de l’étape 2.2.6.
   3. Remplissez une seringue avec le réactif requis et connectez un bout de luer de 23 G, 0,5 po à l’extrémité.
   4. Injectez le réactif dans le tube PTFE correspondant jusqu’à ce que le tube soit plein. Veillez à ce que le réactif ne pénètre pas dans l’orifice de sortie du groupe motopompe.
   5. Insérez l’extrémité libre du tube dans une entrée correspondante dans la puce microfluidique.
   6. Appliquez une pression de 400 mbar sur chacun des réactifs aqueux d’entrée à l’aide du logiciel fourni.
   7. Dépressuriser séquentiellement les canaux de commande individuellement à l’aide du programme d’interface principale (Figure 3) pour s’assurer que tous les réactifs ont atteint la jonction T de l’appareil. Actionnez des vannes individuelles, si nécessaire, en appuyant sur les boutons correspondants du programme dans la boîte Canaux de contrôle Pressurisation manuelle.
   8. Répétez les étapes 3.2.3 à 3.2.5 pour les réactifs d’huile. Appliquer une pression de 400 mbar à chacun des réactifs d’huile d’entrée.
   9. Dépressurisez simultanément tous les canaux de commande en appuyant sur Dépressuriser tous les canaux de commande (Figure 3) jusqu’à ce que tout l’air ait été retiré de l’appareil. Ceci est observable à l’œil nu ou au microscope.
   10. Mettez sous pression tous les canaux de commande en appuyant sur le bouton Pressuriser tous les canaux de commande (Figure 3). À ce stade, tous les réactifs ont été connectés et l’appareil est amorcé et prêt à l’emploi.
3. Programmez et exécutez l’expérience comme décrit ci-dessous.
   1. Encodez la composition, la séquence et les répétitions de chaque population de prises à produire dans un fichier .csv, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 7 qui sert d’entrée pour l’expérience automatique dans le programme d’interface principale (Figure 3). Marquez les canaux de commande nécessaires avec un 0 s’il correspond à une entrée qui doit être ouverte et un 1 si elle doit être fermée. Chaque ligne du fichier .csv correspond à une population de prise distincte.
   2. Chargez le .csv dans le programme Main Interface en cliquant sur le bouton Dossier dans l’onglet Fichier d’expérience .
   3. Entrez les champs pertinents dans le programme tels que les itérations de l’expérience (pour déterminer combien de fois la séquence donnée de bouchons est produite), le temps de dépressurisation (pour déterminer combien de temps les canaux d’entrée doivent être ouverts et le canal de commande correspondant doit être dépressurisé en millisecondes), le temps de pressurisation (pour déterminer combien de temps les entrées doivent être fermées entre les séquences de remplissage de bouchons en millisecondes).
   4. Sélectionnez le(s) canal(s) d’entrée correspondant à la production de codes-barres dans la section Entrées de code-barres (jusqu’à 3 canaux) ainsi que la durée pendant laquelle ils doivent être ouverts (Temps de codage à barres (ms)). Alternativement, ces codes-barres peuvent également être codés en dur dans le fichier .csv d’entrée, comme indiqué dans le fichier supplémentaire 7.
   5. Réduire la pression des réactifs d’huile d’entrée à 200 mbar.
   6. Connectez un tube en PTFE (OD : 0,042 po, ID : 0,022 in) de la longueur souhaitée à la sortie pour recueillir les bouchons. Afin d’assurer une production uniforme des bouchons, utilisez des tubes d’environ 100 cm pré-remplis de bouchons pour la collecte. Il s’agit de neutraliser la différence de pression à la sortie qui est exercée par l’accumulation de bouchons dans le tube.
   7. Appuyez sur Exécuter l’expérience pour démarrer le programme et brancher la production.
4. Effectuez l’enregistrement et l’analyse des données comme décrit ci-dessous (voir Figure 5).
   REMARQUE : Cette section décrit spécifiquement une méthode d’analyse des bouchons fluorescents. Selon la nature des prises générées, cette section peut être modifiée au besoin.
   1. Remplissez une seringue d’huile (huile minérale ou huile fluorée) et connectez un embout Luer de 23 G 0,5 po à l’extrémité. Fixez la seringue à une pompe.
   2. Connectez l’une des extrémités du tube de collecte rempli à l’embout Luer de la seringue. Fixez l’autre extrémité du tube de collecte rempli au-dessus de la lentille de l’objectif d’un microscope.
   3. Placez un réservoir de déchets sous l’extrémité du tube près de l’objectif.
   4. Focalisez le microscope sur une région donnée du tube et réglez-le pour enregistrer la fluorescence dans le(s) canal(s) souhaité(s).
   5. Réglez la pompe à un débit de 50 μL/min.
   6. Enregistrez la vidéo du canal fluorescent sous forme de fichier .avi.
   7. Analysez le fichier .avi à l’aide du script python fourni (Fichier supplémentaire 8) pour extraire la fluorescence moyenne dans une région d’intérêt (ROI) prédéfinie par image du fichier .avi (dont un exemple est donné dans le Fichier supplémentaire 9).
   8. Utilisez le script R personnalisé fourni (Fichier supplémentaire 10) pour extraire les conditions et tracer les données brutes et les hauteurs de crête.
      REMARQUE : Le script R du fichier supplémentaire 10 a été utilisé pour l’analyse dans le présent document. Les fonctions R personnalisées utilisées dans ce script pour couper des données, détecter des conditions à l’aide de codes-barres et analyser les hauteurs de crête pour des prises individuelles et le traçage sont fournies dans le fichier supplémentaire 11.

Résultats

L’une des caractéristiques cruciales de la puce microfluidique sont les vannes PDMS et leur capacité à réguler le débit de fluide a été caractérisée car elle influence le paradigme opérationnel du dispositif. À cette fin, le débit d’eau distillée (mesuré à l’aide d’un capteur de débit commercial) à travers les canaux d’entrée a été enregistré en fonction de différentes pressions d’entrée tout en pressurisant périodiquement (3,5 bar pendant 2000 ms) et dépressurisant (1000 ms) les vannes PDMS (Figure 6A). Il a été observé que les vannes étaient capables de réguler le débit de fluide jusqu’à environ 800 mbar de pression d’entrée, comme l’indique la chute du débit à zéro lorsque les vannes sont actionnées (figure 6 B-D). Cela valide l’utilisation de telles vannes basées sur PDMS pour réguler le débit de réactifs à l’intérieur des canaux. De plus, à 1200 mbar, la pression d’entrée est trop élevée pour que les vannes puissent réguler le débit, comme en témoigne le fait que le débit ne descend pas à zéro (Figure 6E). Bien que la durée de pressurisation et de dépressurisation des vannes PDMS puisse être modifiée, le taux de variation du débit de fluide dans les conditions actuelles de pressurisation (2000 ms) et de dépressurisation (1000 ms) a été calculé. Pour une pression d’entrée de 400 mbar, le débit peut être activé et désactivé à la fréquence de 1,26 Hz et 1,44 Hz respectivement (Figure 6C).

Les itérations précédentes d’un dispositif microfluidique combinatoire à haut débit similaire incorporaient également un canal de déchets couplé à chaque canal d’écoulement^46,47. Ces dispositifs ont été exploités dans un régime de débit constant (où les réactifs ont été injectés dans l’appareil à des débits constants plutôt qu’à pression constante), et les canaux de déchets ont été programmés pour s’ouvrir lorsque leurs canaux d’entrée correspondants étaient fermés afin d’atténuer toute accumulation de pression. De tels canaux, bien qu’utiles, entraînent une perte de réactifs car le contenu du canal de déchets ne contribue pas à la formation de bouchons. De plus, des canaux de régulation supplémentaires - et donc des pompes supplémentaires - sont également nécessaires pour réguler l’ouverture et la fermeture des canaux d’évacuation. Dans le prototype présenté ici, les canaux de déchets ont été supprimés et un paradigme opérationnel a été établi qui permet de réduire le gaspillage de réactifs et de réduire la conception et la complexité opérationnelle. Il s’agit d’injecter les réactifs aqueux en mode pression constante par opposition au mode à débit constant. Pour mieux comprendre les deux régimes, la relation entre la pression et le débit dans les canaux lors de l’actionnement de la vanne a été évaluée dans chaque cas (en utilisant la même configuration que celle illustrée à la figure 6A), dont les résultats sont présentés à la figure 7. Sur la figure 7A, le débit d’eau distillée a été mesuré lors de l’injection à une pression constante (300 mbar) et il a été observé que lors de l’actionnement de la vanne, le débit tombe à zéro et qu’à la dépressurisation de la vanne, le débit revient aux niveaux d’avant l’actionnement. Cependant, dans un régime de débit constant, dans lequel la pression dans les canaux a été enregistrée lors de l’injection de l’eau distillée à un débit constant (2,5 μL/min ; Figure 7B), l’actionnement de la soupape n’a pas entraîné la fermeture complète de l’entrée - comme en témoigne le fait que le débit n’est pas tombé à zéro - et une augmentation de la pression dans le canal a été observée. C’est la pression qui est soulagée par l’ouverture des canaux d’évacuation. Étant donné qu’un régime de pression d’entrée constante permet le fonctionnement de l’appareil sans contre-pression lors de l’actionnement de la vanne, éliminant ainsi le besoin de canaux de décharge, ce régime a été adopté pour le fonctionnement de la puce microfluidique.

Pour démontrer la fonctionnalité du dispositif microfluidique, une bibliothèque combinatoire quantitative de bouchons fluorescents a été générée. Aux huit entrées de l’appareil, trois réactifs aqueux - fluorescéine (50 μM) en quatre entrées (I₁Je_3, Je_5, Je₇), de l’eau distillée dans trois entrées (I₄Je_6, Je₈), une entrée avec un colorant de couleur bleue (I₂; pour agir comme un code-barres) - et deux réactifs d’huile - l’huile fluorée (FC-40) et l’huile minérale (MO) dans les entrées O₁ et O₂, respectivement - étaient branchés (Graphique 1A, Graphique 8A). L’huile fluorée sert de phase porteuse dans laquelle les bouchons aqueux sont dispersés, et l’huile minérale aide à la stabilité des bouchons et minimise l’adhérence du contenu des bouchons aux parois, minimisant ainsi la contamination croisée entre les bouchons⁴⁶. Avec trois entrées contribuant à la composition d’une seule population de bouchons, cette configuration peut générer trois populations fluorescentes distinctes : FFF - composée de fluorescéine à partir de trois canaux, FFW - composée de fluorescéine à partir de deux canaux et d’eau à partir d’un canal, et FWW - composée de fluorescéine à partir d’un canal et d’eau à partir de deux canaux. Avec cette configuration, il y a 12 conditions distinctes (populations de prises produites avec une combinaison distincte de trois entrées) qui peuvent produire des prises FWW, 18 conditions distinctes qui peuvent produire des prises FFW, et quatre conditions distinctes qui peuvent produire des prises FFF. Par conséquent, la puce a été programmée pour produire ces 34 conditions différentes avec cinq répliques différentes chacune, ainsi que cinq répliques de bouchons de code-barres les séparant. Il est recommandé d’intercaler les populations de bouchons fluorescents avec un remplissage de code-barres, c’est-à-dire un ensemble de bouchons colorés (idéalement non fluorescents) (dans ce cas, formés par l’ouverture des canaux d’entrée correspondant au colorant bleu et à deux canaux d’eau distillée) qui sont visibles à l’œil nu. Il permet à l’utilisateur de surveiller la production de bougies pour détecter des problèmes tels que la rupture ou la fusion des bougies et facilite l’analyse en aval des bouchons. Par conséquent, un total de 340 bouchons - 170 bouchons expérimentaux et 170 bouchons de codage à barres séparant les différentes conditions - ont été générés et collectés dans des tubes en PTFE, dont un échantillon est présenté dans Graphique 8B. Le temps de dépressurisation et le temps de pressurisation ont été réglés à 1000 ms et 2000 ms, respectivement. La fluorescence des bouchons et leur variabilité au sein et à travers les différentes conditions expérimentales ont été analysées, dont les résultats sont présentés dans Graphique 8C,D. Graphique 8C Affiche la fluorescence par image du fichier .avi généré à l’étape 3.4.6, qui met en évidence les 34 conditions expérimentales considérées (délimitées par une ligne bleue). La valeur fluorescente moyenne des pics dans une condition est indiquée en rouge et les lignes pointillées indiquent l’erreur type dans cette condition. Les hauteurs des pics de tous les bouchons de chaque population, obtenues en soustrayant la fluorescence de base de la fluorescence maximale détectée dans chaque pic, ont été tracées en Graphique 8D. Le dernier pic de chaque condition a été négligé pour les calculs car il s’agissait d’un bouchon contaminé en raison du mélange de réactifs à la jonction T (puisque la fluorescence des bouchons a été enregistrée dans l’ordre inverse de la production du bouchon, le premier bouchon d’une population pendant la production est le dernier bouchon d’une population pendant l’analyse). Il était évident que la hauteur des prises FWW est d’environ un tiers (moyenne = 40,9, écart-type = 3,1) et celle des prises FFW est d’environ deux tiers (moyenne = 78,4, écart-type = 5) de la hauteur des prises FFF (moyenne = 117, écart-type = 10). Ces résultats correspondent aux proportions attendues de fluorescence dans différentes populations de prises FFF/FFW/FWW, ce qui met en évidence la robustesse du dispositif et son fonctionnement.

Figure 1 : Schéma de la conception du dispositif et de la configuration microfluidique. (A) La couche d’écoulement de la puce est représentée en bleu et la couche de contrôle est représentée en rouge. Au total, huit réactifs aqueux uniques peuvent s’écouler à travers les entrées (I_1-8) vers la jonction en T, où ils rencontrent les phases huileuses des entrées d’huile (O_1-2) pour former des bouchons qui sont collectés à la sortie. Chaque canal d’écoulement d’entrée est sous le contrôle d’un canal de contrôle unique (C_1-8). (B) Le schéma de la puce microfluidique ainsi que les connexions des tubes aux entrées, aux canaux de contrôle et aux réactifs d’huile sont illustrés avec le tube de sortie. Les flèches indiquent la direction de l’écoulement du fluide dans le tube. L’encart montre le principe de fonctionnement des vannes PDMS. Les lignes pointillées indiquent que la couche de contrôle se trouve sous la couche de flux. Cette figure a été modifiée à partir de Dubuc et al⁴⁹. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Schéma de la configuration matérielle pour la production de prises. Les pompes à pression contrôlent le débit des réactifs (aqueux et huileux) dans les canaux d’entrée, et les électrovannes contrôlent l’actionnement des vannes PDMS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Le principal programme d’interface pour contrôler le dispositif microfluidique. Ce programme sur mesure permet la pressurisation manuelle de vannes pneumatiques individuelles (panneau blanc). Il permet également l’exécution d’une expérience complète (panneau bleu) où il accepte un fichier .csv avec les populations de bouchons souhaitées et les paramètres nécessaires tels que les temps de pressurisation et de dépressurisation des vannes et affiche l’état de l’exécution de l’expérience, y compris les canaux de contrôle qui sont pressurisés et non, en temps réel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Actionnement de la vanne entraîné par pression. Images de microscopie à fond clair de (A) la vanne PDMS (horizontale) en cours de dépressurisation et l’ouverture du canal d’entrée (vertical) et (B) la vanne PDMS étant pressurisée et fermant le canal d’entrée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Schéma de la configuration de l’enregistrement des données. Le tube de collecte est relié à une seringue avec de l’huile, qui est fixée à une pompe. Les bouchons sont lancés à travers le tube de collecte, et des images/vidéos sont capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Effet de l’actionnement de la vanne sur le débit à une pression d’entrée donnée. (A) Schéma de la configuration matérielle utilisée pour surveiller le débit dans les canaux microfluidiques. La réponse du débit dans les canaux lorsqu’ils fonctionnent à différentes pressions d’entrée de (B) 200 mbar, (C) 400 mbar, (D) 800 mbar et (E) 1200 mbar. La durée d’actionnement de la vanne est indiquée dans la zone ombrée en rouge. L’eau distillée a été utilisée pour toutes les expériences. L’écart-type de trois mesures indépendantes est indiqué par la région ombrée en vert. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Relation entre la pression et le débit des réactifs dans les canaux d’entrée lors de l’actionnement de la vanne. (A) Dans une vanne à régime de pression d’entrée constante (300 mbar), le débit tombe à zéro lors de l’actionnement de la vanne. (B) Dans un régime de débit constant (2,5 μL/min), l’actionnement de la vanne entraîne une accumulation rapide de pression dans le canal jusqu’à ce que la vanne soit dépressurisée. La durée d’actionnement de la vanne est indiquée dans la zone ombrée en rouge. L’eau distillée a été utilisée pour toutes les expériences. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Production de populations de bouchons fluorescents. (A) Schéma du dispositif expérimental illustrant la connexion des différents réactifs au dispositif. Abréviations : F = fluorescéine, W = eau distillée, B = colorant alimentaire bleu, FC-40 = huile fluorée et MO = huile minérale. (B) Exemple de photo d’un tube de collecte contenant des bouchons. (C) Les données brutes obtenues à partir de l’analyse montrent l’intensité moyenne de fluorescence mesurée dans une région d’intérêt (ROI) spécifiée par rapport au numéro d’image du fichier vidéo. Les lignes rouges indiquent la moyenne de la fluorescence maximale pour chaque condition (population de bouchons produits avec une combinaison spécifique de trois entrées), et les lignes pointillées montrent l’erreur type correspondante. (D) Boîtes à moustaches de la hauteur des sommets dans les différentes conditions. Les points correspondent à des pics individuels, les cases pour chaque condition vont du premier au troisième quartile de la distribution des pics correspondants, et la ligne épaisse est utilisée pour la valeur médiane. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Le programme d’interface principal pour le fonctionnement de l’appareil. L’interface de contrôle pour la pressurisation manuelle des canaux de commande et l’exécution d’une expérience automatique dans le dispositif à huit entrées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Programme d’interface principal alternatif pour le fonctionnement de l’appareil. L’interface de commande pour faire fonctionner un appareil à huit entrées sans fonction de code-barres. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3 : Sous-programme LabVIEW avec variables globales. SubVI du programme d’interface principal listant et affichant l’état des variables globales dans le programme d’interface principal, à savoir les canaux de contrôle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4 : Programme LabVIEW pour enregistrer les valeurs des variables globales. Sous-VI du programme d’interface principal qui enregistre l’état actuel des vannes sous forme de tableau, qui sera utilisé pour maintenir le même état des vannes en cas d’inactivité de l’utilisateur pendant plus de 30 secondes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 5 : Programme LabVIEW TCP (Transmission Control Protocol). SubVI pour maintenir la connexion TCP entre le programme d’interface principal et le contrôleur WAGO. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 6 : Variable globale TCP sous-programme LabVIEW. Programme de stockage de la variable de sortie TCP. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 7 : Entrée pour la réalisation d’une expérience automatique. Le fichier .csv codant la composition, la séquence et les répliques des populations de bouchons pour la réalisation d’expériences visant à produire des bouchons fluorescents quantitatifs, comme détaillé dans cet article. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 8 : Script Python pour l’analyse de la population de bouchons fluorescents. Script python personnalisé pour lire les valeurs de fluorescence à partir de l’enregistrement des bouchons (fichier .avi). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 9 : Sortie de l’analyse de fluorescence des bouchons. Sortie du script Python contenant des valeurs de fluorescence pour un retour sur investissement de 5x5 à partir de l’enregistrement des prises. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 10 : Programme R pour lire le fichier de sortie. Programme personnalisé utilisé dans ce travail pour lire les valeurs fluorescentes de sortie et tracer les données brutes, les hauteurs de crête et les écarts-types. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 11 : Fonctions R pour l’analyse et le tracé des données fluorescentes. Fonctions R personnalisées qui sont utilisées pour 1. Coupez les données brutes des valeurs fluorescentes, 2. définir différentes conditions expérimentales, 3. identifier les pics à partir des conditions données, 4.tracer les données brutes et les conditions détectées se chevauchent, et 5. Tracez les pics identifiés et les données brutes qui se chevauchent. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans cet article, un ensemble de protocoles pour la fabrication et l’exploitation d’un dispositif microfluidique basé sur PDMS pour la génération automatisée de banques combinatoires dans des compartiments d’eau dans l’huile appelés bouchons a été présenté. La combinaison de la microfluidique et de la technologie des gouttelettes fournit une technique puissante pour encapsuler de petites quantités de réactifs dans un grand nombre de compartiments, ouvrant ainsi la voie à un criblage combinatoire à grande échelle.

Auparavant, plusieurs technologies ont été décrites pour générer des compartiments chimiquement distincts à l’aide de la microfluidique, chacune avec ses avantages et ses limites. Kulesa et ^al.50, ont décrit une stratégie consistant à encapsuler des cellules avec des codes-barres dans des gouttelettes à l’aide de plaques de microtitration et à fusionner ces gouttelettes à l’aide d’un champ électrique pour créer une bibliothèque combinatoire. Bien qu’une telle approche puisse générer de nombreuses combinaisons de gouttelettes, elle est limitée par la nécessité d’effectuer des étapes de manipulation manuelle dans le flux de travail. Tomasi et ^al.51 ont développé une plateforme microfluidique pour fusionner une gouttelette contenant des sphéroïdes (agrégats de cellules flottantes libres) avec une gouttelette de stimulus, permettant ainsi la manipulation du microenvironnement sphéroïde. Cette méthode permet d’étudier des phénomènes importants tels que les interactions cellule-cellule et l’effet des médicaments, mais son débit est relativement faible. Eduati et ^al.46 et Utharala et ^al.47 ont développé une plate-forme basée sur des vannes microfluidiques qui peut générer des bibliothèques combinatoires à haut débit de manière automatisée. Cependant, dans ces études, les vannes sont actionnées à l’aide d’un dispositif braille, ce qui nécessite des étapes d’alignement lourdes entre la microvanne et la puce microfluidique. Une caractéristique clé du système décrit dans cet article est la mise en œuvre de vannes pneumatiques PDMS pour réguler le débit de fluide dans les canaux d’entrée. Comme ces vannes sont basées sur le PDMS, elles peuvent être incorporées assez facilement dans les étapes de fabrication de la puce microfluidique. De plus, ils constituent une option relativement simple pour contrôler le débit de liquides dans les canaux d’entrée, car ils peuvent être actionnés en appliquant une pression à travers une source de gaz externe. Enfin, la durée et la séquence de pressurisation et de dépressurisation de ces vannes peuvent être programmées, automatisant ainsi la production de populations distinctes de bouchons à haut débit. Une autre caractéristique importante est l’utilisation de régimes de pression constante pour l’injection de réactifs par l’entrée, ce qui permet de choisir de ne pas incorporer de canaux de déchets pour soulager toute accumulation de pression qui se produit dans un régime de débit constant. Cela simplifie la conception de l’appareil, réduit le besoin de vannes et de matériel supplémentaires pour contrôler les vannes du canal de déchets et minimise le gaspillage de réactifs.

Bien que la fabrication d’appareils avec PDMS soit relativement simple, la mise en œuvre de tels appareils nécessite l’utilisation d’un vaste équipement matériel tel que les électrovannes pneumatiques (pour contrôler l’actionnement des vannes PDMS), les pompes à pression (pour contrôler le débit des réactifs d’admission et d’huile) et les logiciels (pour réguler les électrovannes). Bien qu’ils représentent un investissement important, une telle configuration offre cohérence et fiabilité pour le bon fonctionnement de l’appareil. De plus, les composants matériels et l’architecture décrits dans ce protocole sont configurés de manière modulaire. Par conséquent, des alternatives peuvent être utilisées pour certains modules afin de réduire les coûts ou de les adapter à un besoin spécifique. Par exemple, il existe une variété de pompes qui peuvent être utilisées en fonction de l’utilité, du budget, de la disponibilité et de la commodité 52,53,54. Des composants supplémentaires tels que des réservoirs de fluide et des régulateurs de température peuvent être incorporés pour les réactifs d’entrée sensibles²³. De plus, cette conception peut être augmentée ou réduite pour répondre à des besoins scientifiques spécifiques. Par exemple, dans cet article, un prototype à huit entrées est décrit qui permet de combiner huit réactifs uniques pour produire des bouchons. Il peut être mis à l’échelle jusqu’à un dispositif à 16 entrées, ce qui permet un plus grand nombre d’entrées et de plus grandes combinaisons de celles-ci. Par conséquent, il aura besoin de canaux de contrôle et d’électrovannes supplémentaires pour traiter les entrées, mais un tel prototype permet de générer des bibliothèques combinatoires plus grandes et plus diversifiées. Enfin, dans cet article, chaque population de bouchons est produite par l’ouverture de trois des huit entrées aqueuses du dispositif microfluidique. Il a été observé que, pour une telle configuration, une pression d’environ 200 mbar pour les réactifs d’huile et de 400 mbar pour les réactifs aqueux correspondait à un régime de production de bouchons, qui est entraîné uniquement par l’actionnement de la vanne. Lorsque des pressions plus élevées ont été appliquées à l’huile ou aux huiles, une rupture des bouchons a été observée, et l’application de pressions plus basses a conduit à une fusion des bouchons. Le régime de pression optimal pour la production de bouchons dépend d’un large éventail de facteurs, tels que le nombre d’entrées contribuant à la formation d’un bouchon, la nature et la viscosité des fluides, ainsi que les dimensions des canaux, et doit être optimisé si nécessaire.

L’un des inconvénients de fonctionner dans un régime à pression constante est que les fluides de viscosités différentes ont des débits différents sous pression constante. Par conséquent, il faut s’assurer que les réactifs aqueux circulant à travers les entrées ont des viscosités comparables. L’utilisation de fluides de viscosités différentes affectera non seulement l’écoulement des fluides dans les canaux d’entrée, mais également la formation de bouchons à la jonction en T, compromettant ainsi la composition des populations de bouchons. Un autre inconvénient est la contamination d’une population de bouchons par des réactifs résiduels à la jonction T. Lorsque l’appareil bascule entre la production de différentes populations de prises, la première/dernière prise de la séquence de chaque population a tendance à être contaminée par la population précédente ou la suivante. Ce problème peut être surmonté en produisant des répétitions supplémentaires de chaque population et en réduisant la prise contaminée lors de l’analyse. Enfin, il existe également un risque de variation entre les dispositifs individuels en raison d’incohérences dans la fabrication et/ou de sources externes (fluctuations de pression). Ce problème peut être atténué en réutilisant plusieurs fois une seule puce microfluidique et en s’assurant qu’une exécution complète d’une bibliothèque combinatoire est effectuée sur une seule puce afin de minimiser l’effet de ces incohérences.

Le dispositif microfluidique et l’ensemble de protocoles opérationnels qui l’accompagne présentés dans cet article ont été utilisés pour démontrer la production d’une bibliothèque combinatoire quantitative de bouchons. Cette plate-forme peut donc générer rapidement des bibliothèques combinatoires de populations de bouchons distinctes à haut débit. Par conséquent, ces technologies peuvent être utilisées à diverses fins de dépistage, y compris, mais sans s’y limiter, le criblage combinatoire de médicaments sur des échantillons de biopsie de patients - où un petit nombre de cellules prélevées d’une biopsie peut être distribué dans un grand nombre de gouttelettes et traitées avec une grande combinaison de médicaments anticancéreux afin d’optimiser le traitement individuel pour un échantillon de patient donné - et donc d’accélérer le traitement personnalisé du cancer^{46, 48,55}.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1,3,3 tetramethyldisiloxane	Merck Life Science NV	MFCD00008256
4 channel digital input/output module	WAGO Kontakttechnik GmbH	750-504
Acetone	Boom Labs	BOOMSKEUZW3
Analysis Software	Eindhoven University of Technology	https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE
AZ 40XT 11D	Merck Life Science NV	212299	Positive photoresist
AZ 726 MIF developer	Merck Life Science NV	10055824960	Developer for positive photoresist
Biopsy Punch, Rapid Core	World Precision Instruments Germany, GMBH	504529	0.75 mm ID, W/Plunge
Blue food dye	PME	FC1036
Controller end module	WAGO Kontakttechnik GmbH	750-600
Ethernet Controller	WAGO Kontakttechnik GmbH	750-881
FC-40	Merck Millipore	F9755-100ML
Fluigent flow unit	Fluigent	FLU-S-D
Fluigent pressure system	Fluigent	MFCS-EZ	0 - 2 bar
Fluorescein	Merck Life Science NV	MFCD00005050
Hot plate	Torrey Pines Scientific	HP61
Inverted microscope	Nikon Instruments	Eclipse Ti-E
Isopropanol	Boom Labs	BOOMSKEUZE3
LabVIEW (Software Version 20)	Eindhoven University of Technology	https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_ VERSION_1	All files have been saved for LabVIEW version 20. It is advised to use this version or higher to open the files.
Luer stubs	Instech Laboratories, Inc.	LS23	23 ga, 0.5"
Male Luer to barb connectors	Cole Parmer	45505-32	3/32" ID
MasterFlex PTFE tubing	Avator/VWR	48634
Microscope Slides	VWR	470150-480
Microscope slides,  Plain	Corning	2947-75X50
Mineral Oil	Merck Millipore	330760-1L
mr DEV 600	Micro resist Technology	R815100	Developer for negative photoresist
Oven	Thermo Scientific	Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher	Quorum Technologies	K1050X
Photomask	CAD/Art Services, Inc.
Photomask Design	Eindhoven University of Technology (Adapted from Merten Lab, EPFL)	https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg
Pneumatic valve array	FESTO		1x 8 valve array, Normally closed valves
Silicon Wafers	Silicon Materials		<1-0-0>, 100 mm diameter, 525 μm thickness
Single edge blades	GEM Scientific
Soft tubing	Fluigent		1 mm ID, 3 mm OD
Spin coater	Laurell Technologies Corporation	WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope	Olympus Corporation	SZ61
SU-8 3050	Kayakli Advanced Materials	Y311075 1000L1GL	Negative photoresist
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow	1317318
Syringe	B Braun Injekt - F Fine Dosage Syringe	10303002
UV-LED exposure system	Idonus	UV-EXP150S-SYS
Vacuum pump	Vacuumbrand GmbH	MD1C
Weighing scales	Sartorius	M-prove