Trois stratégies pour induire la kératite neurotrophique et la régénération nerveuse dans la cornée murine

Résumé

Nous proposons ici trois méthodes différentes pour endommager les fibres sensorielles qui innervent la cornée. Ces méthodes facilitent l’étude de la régénération axonale chez la souris. Ces trois méthodes, adaptables à d’autres modèles animaux, sont idéales pour l’étude de la physiologie et de la régénération de l’innervation cornéenne.

Résumé

La cornée est un tissu transparent qui recouvre l’œil et qui est crucial pour une vision claire. C’est le tissu le plus innervé du corps. Cette innervation procure sensation et fonction trophique à l’œil et contribue à préserver l’intégrité cornéenne. La perturbation pathologique de cette innervation est appelée kératite neurotrophique. Cela peut être déclenché par une blessure à l’œil, une intervention chirurgicale ou une maladie. Dans cette étude, nous proposons trois protocoles différents pour infliger des dommages à l’innervation de manière à récapituler les trois types de cas généralement rencontrés en clinique.

La première méthode consiste à effectuer une abrasion de l’épithélium à l’aide d’une fraise ophtalmique. Cela implique l’ablation de la couche épithéliale, des terminaisons nerveuses libres et du plexus sous-basal d’une manière similaire à la chirurgie de kératectomie photoréfractive réalisée en clinique. La deuxième méthode ne cible l’innervation qu’en la sectionnant à la périphérie avec un poinçon de biopsie, en maintenant l’intégrité de l’épithélium. Cette méthode est similaire aux premières étapes de la kératoplastie lamellaire et conduit à une dégénérescence de l’innervation suivie d’une repousse des axones dans la cornée centrale. Cette dernière méthode endommage l’innervation d’un modèle de souris transgénique à l’aide d’un microscope multiphotonique, qui localise spécifiquement le site de cautérisation des fibres nerveuses fluorescentes. Cette méthode inflige les mêmes dommages que la photokératite, c’est-à-dire une surexposition aux rayons UV.

Cette étude décrit différentes options pour étudier la physiopathologie de l’innervation cornéenne, en particulier la dégénérescence et la régénération des axones. Favoriser la régénération est crucial pour éviter des complications telles que des défauts de l’épithélium ou même une perforation de la cornée. Les modèles proposés peuvent aider à tester de nouvelles molécules pharmacologiques ou des thérapies géniques qui améliorent la régénération nerveuse et limitent la progression de la maladie.

Introduction

La cornée, qui est la surface transparente de l’œil, est composée de trois couches distinctes : l’épithélium, le stroma et l’endothélium. Cet organe a la plus forte densité d’innervation dans le corps et est composé principalement de fibres sensorielles (types Aδ et C) provenant de la branche ophtalmique du ganglion trijumeau. Les fibres sensorielles pénètrent à la périphérie de la cornée dans le stroma moyen sous la forme de gros faisceaux qui se ramifient pour couvrir la surface. Ils bifurquent ensuite pour percer la membrane de Bowmann et former le plexus sous-basal, facilement reconnaissable par la formation d’un vortex au centre de la cornée. Ces fibres se termin....

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par le National Animal Experiment Board.

1. Préparatifs

1. Préparez une solution anesthésique de kétamine-xylazine pour l’anesthésie. Injecter de la kétamine à 80 mg/kg et de la xylazine à 10 mg/kg en diluant 200 μL de kétamine (100 mg/mL) et 125 μL de xylazine (20 mg/mL) dans 2 175 mL de NaCl stérile à 0,9 %.
2. Préparer une solution de buprénorphine à 0,02 mg/mL comme solution analgésique en ajoutant 100 μL de buprénorphine à 0,3 mg/mL à 1 400 mL de NaCl stérile à 0,9 %.
3. Préparez la solution de coloration fluorescente.
   1. À l’aide d’une balance....

Discussion

La kératite neurotrophique est considérée comme une maladie rare, affectant 5 personnes sur 10 000. Cependant, les personnes souffrant de NK en raison d’une blessure physique telle que des brûlures chimiques, ou des syndromes tels que le diabète ou la sclérose en plaques ne sont pas incluses dans ces statistiques³. De plus, cette affection reste largement sous-diagnostiquée²² et la prévalence de la maladie est sous-estimée. Il existe un fort besoin de nouveaux tr.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 µm seringe filter	CLEARLINE	51733
0.5 mm rust ring remover	Alger Equipment Company	BU-5S
2 mL plastic tubes	Eppendrof	30120094
Algerbrush burr, Complete instrument	Alger Equipment Company	BR2-5
Anti-beta III Tubulin antibody	Abcam	ab18207
Antigenfix	Diapath	P0016
Artificial tear	Larmes artificielles Martinet	N/A
Buprecare	Animalcare	N/A
Cotton swab	Any provider	N/A
Dissecting tools	Fine Science Tools	N/A
Fluorescein	Merck	103887
Gelatin from cold water fish skin	Sigma	G7765
Goat serum	Merck	S26
Head Holder	Narishige	SGM 4
Heated plate	BIOSEB LAB instruments	BIO-HE002
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
Imalgene 1000	BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992
LAS X software	Leica	N/A	Large volume computational clearing (LVCC) process
Laser Chameleon Ultra II	Coherent	N/A
Laser power meter	Coherent	N/A
Leica Thunder Imager Tissue microscope	Leica	N/A
Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope	Zeiss	N/A
Ocry-gel	TVM lab	N/A
Parametric oscillator	Coherent	N/A
Penlights with blue cobalt filtercap	Bernell	ALPEN
Petri dish	Thermo Scientific	150318	Axotomy protocol
Petridish	Thermo Scientific	150288	Cornea whole-mount processing
Rompun 2%	Elanco	N/A	French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980
Sterile biopsy punch 2.5 mm	LCH medical	LCH-PUK-25
Triton X-100	VWR	0694
Vectashield	EuroBioSciences	H-1000	Mounting medium