Collecte simultanée de cerveau et de sérum de souris fœtales pour évaluer les effets de l’alimentation maternelle sur la nutrition et le développement neurologique dans la neurofibromatose de type 1

Résumé

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de collecte simultanée de tissu cérébral fœtal ainsi que de sérum non hémolysé de haute qualité à partir du même embryon de souris. Nous avons utilisé cette technique pour interroger comment l’exposition alimentaire maternelle affecte les profils de macronutriments et le développement neurologique fœtal chez des souris hétérozygotes pour Nf1 (neurofibromatose de type 1).

Résumé

Il a été démontré que l’obésité induite par l’alimentation maternelle modifie le développement neurologique de la progéniture, ce qui peut entraîner une réduction des capacités cognitives, une hyperactivité et des altérations du comportement social. Les patients atteints de la maladie génétique cliniquement hétérogène Neurofibromatose de type 1 (NF1) peuvent présenter des déficits similaires, mais il n’est actuellement pas clair si des facteurs environnementaux tels que l’alimentation maternelle influencent le développement de ces phénotypes, et si oui, le mécanisme par lequel un tel effet se produirait. Pour permettre d’évaluer comment l’exposition maternelle au régime obésogène affecte les facteurs systémiques pertinents pour le développement neurologique dans la NF1, nous avons mis au point une méthode pour collecter simultanément du sérum non hémolysé et des cerveaux entiers ou micro-disséqués régionalement à partir de progénitures fœtales de mères murines nourries avec un régime témoin par rapport à un régime riche en graisses et en saccharose. Les cerveaux ont été traités pour la cryosection ou la congélation instantanée afin d’être utilisés pour l’isolement ultérieur de l’ARN ou des protéines ; La qualité du tissu collecté a été vérifiée par immunomarquage. La qualité du sérum a été vérifiée en analysant les profils de macronutriments. En utilisant cette technique, nous avons identifié que le régime obésogène maternel augmente le cholestérol sérique fœtal de la même manière entre les chiots WT et Nf1-hétérozygotes.

Introduction

La neurofibromatose de type 1 (NF1) est considérée comme une RASopathie, un groupe de troubles caractérisés par des mutations génétiques germinales entraînant l’activation de la voie de signalisation RAS/MAPK (RAt Sarcoma virus/Mitogen-activated Protein Kinase). Les patients atteints de la RASopathie NF1 sont à risque de développer de nombreuses manifestations différentes, y compris des tumeurs bénignes et malignes du système nerveux central (gliome de la voie optique ^1,2, gliome de haut grade ^3,4) et périphérique (neurofibrome plexiforme

Protocole

Toutes les procédures animales de cette étude ont suivi les directives du NIH et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Washington à St. Louis. Les animaux ont été logés avec un cycle standard de 12 h lumière/obscurité et un accès libre à la nourriture et à l’eau.

1. Alimentation maternelle

1. Placez les souris femelles sous régime alimentaire témoin (CD) ou obésogène (Ob) à l’âge de 4 semaines.
2. À l’âge de 8 à 12 semaines, établissez un accouplement chronométré en surveillant le bouchon muqueux du barrage tôt le ....

Discussion

Les méthodes traditionnelles de prélèvement de sang chez la souris comprennent le rétrobulbaire, la veine caudale, la veine saphène, la veine faciale et le saignement de la veine jugulaire 40,41,42. Malheureusement, ces méthodes ne sont pas idéales pour la collecte de sang embryonnaire en raison de la taille de l’animal et de la petite et délicate vascularisation. La collecte de sang p.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5/45 Forceps	Dumont	11251-35	tip shape: angled 45°
4200 Tapestation	Agilent	G2991BA	Verify RNA integrity and quality, measurement of RIN values
Benchtop Liquid Nitrogen Container	Thermo Fisher	2122	Or other cryo-safe container
Control Chow	PicoLab	5053	Research diets D12328 (low-fat, low-sugar) may also be used.
Curved Forceps	Cole Parmer	UX-10818-25	Tip shape: curved 90°
Dissecting blade handle	Cole-Parmer Essentials	10822-20	SS Siegel-Type, #10 to #15 blades
EMS SuperCut Dissection Scissors	Electron microscope sciences	72996-01	5½" (139.7 mm), Straight
GFAP Antibody	Abcam	ab7260	Dilute 1:350. Block with 10% serum containing 0.3 M Glycine.
Glassvan Carbon Steel Surgical Blades, Size 11	MYCO medical	2001T-11	#11 blades allow straight, flat cut
Micro lab spoon	Az Scilab	A2Z-VL001	stainless steel, autoclavable
Micro scissors	Rubis	78180-1C3	model 1C300
Minivette POCT neutral	Sarstedt	17.2111.050	nominal volume: 50 µL, without preparation
Nanorop	Thermo Fisher	13-400-519	Measure RNA concentration, 260/280 ratios
Obesogenic diet	Researchdiets.com	D12331	High-fat, high-sucrose
Total Cholesterol Reagent	Thermo Fisher	TR13421	Colorimetric detection
β-actin antibody	Cell Signaling	8457	Dilute 1:1,000.