Modèle murin de pince hilaire pulmonaire gauche de lésion de reperfusion d’ischémie pulmonaire

Résumé

Le protocole décrit une méthode réalisable, fiable et reproductible de clampage hilaire pulmonaire gauche qui peut être utilisée pour étudier les lésions d’ischémie-reperfusion pulmonaire dans des modèles murins.

Résumé

Les lésions d’ischémie-reperfusion (IRI) lors d’une transplantation pulmonaire sont un facteur de risque majeur de complications post-greffe, notamment le dysfonctionnement primaire du greffon, le rejet aigu et chronique et la mortalité. Les efforts déployés pour étudier les fondements de l’IRI ont conduit au développement d’un modèle murin fiable et reproductible de clampage hilaire du poumon gauche. Ce modèle implique une intervention chirurgicale réalisée sur une souris anesthésiée et intubée. Une thoracotomie gauche est pratiquée, suivie d’une mobilisation pulmonaire soigneuse et d’une dissection du hile pulmonaire gauche. La pince hilaire implique une ligature de suture réversible du hile pulmonaire avec un nœud coulant, qui arrête l’entrée artérielle, l’écoulement veineux et le flux d’air à travers la bronche principale gauche. La reperfusion est initiée par un retrait soigneux de la suture. Notre laboratoire utilise 30 min d’ischémie et 1 h de reperfusion pour le modèle expérimental dans les investigations actuelles. Cependant, ces périodes peuvent être modifiées en fonction de la question expérimentale spécifique. Immédiatement avant le sacrifice, des gaz sanguins artériels peuvent être obtenus du ventricule gauche après une période de 4 minutes de clampage hilaire droit pour s’assurer que les valeurs de PaO₂ obtenues sont attribuées au poumon gauche blessé seul. Nous décrivons également une méthode pour mesurer l’extravasation cellulaire par cytométrie en flux, qui implique l’injection intraveineuse d’un anticorps marqué au fluorochrome spécifique de la ou des cellules à étudier avant le sacrifice. Le poumon gauche peut ensuite être prélevé pour la cytométrie en flux, l’immunohistochimie congelée ou fixe, l’immunohistochimie intégrée à la paraffine et la réaction en chaîne quantitative par polymérase. Cette technique de clamp hilaire permet d’étudier en détail les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’IRI. Les résultats représentatifs révèlent une diminution de l’oxygénation du poumon gauche et des signes histologiques de lésions pulmonaires après clampage hilaire. Cette technique peut être facilement apprise et reproduite par le personnel avec ou sans expérience en microchirurgie, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et cohérents et de servir de modèle largement adoptable pour l’étude de l’IRI pulmonaire.

Introduction

L’IRI lors de la transplantation d’organe est un facteur de risque majeur de dysfonctionnement primaire du greffon et d’épisodes ultérieurs de rejet du greffon ^1,2. Au cours de la transplantation, le temps d’ischémie chaude est défini comme la période de temps entre la clampage aortique croisé du donneur et le début de la perfusion froide et entre le retrait de l’organe de la glace et l’implantation de l’organe. Le temps de stockage au froid est défini comme la période de temps entre le début de la perfusion froide et le retrait de l’organe de la glace³. L’ischémie chaude est plus délét....

Protocole

Toutes les études ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine de l’Université de Washington. Les animaux ont reçu des soins sans cruauté conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, 8^e édition²¹ préparé par la National Academy of Sciences et publié par les National Institutes of Health, et aux Principes de soins aux animaux de laboratoire formulés par la National Society for Medical Research.

1. Anesthésie et intubation

1. Sélectionnez une souris qui pèse au moins 25 g. Cela f....

Discussion

Nous décrivons une technique de clamp hilaire qui implique l’application d’un nœud coulant sur le hile gauche qui obstrue l’artère et les veines pulmonaires et les bronches pour induire une ischémie chaude suivie d’une reperfusion. Après le clampage hilaire, le poumon gauche peut être prélevé pour diverses techniques expérimentales telles que l’histologie, la cytométrie en flux, le séquençage en vrac ou sur cellule unique et la réaction en chaîne quantitative par polymérase. De plus, le sang et l.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection