Modèle murin de pince hilaire pulmonaire gauche de lésion de reperfusion d’ischémie pulmonaire

Résumé

Le protocole décrit une méthode réalisable, fiable et reproductible de clampage hilaire pulmonaire gauche qui peut être utilisée pour étudier les lésions d’ischémie-reperfusion pulmonaire dans des modèles murins.

Résumé

Les lésions d’ischémie-reperfusion (IRI) lors d’une transplantation pulmonaire sont un facteur de risque majeur de complications post-greffe, notamment le dysfonctionnement primaire du greffon, le rejet aigu et chronique et la mortalité. Les efforts déployés pour étudier les fondements de l’IRI ont conduit au développement d’un modèle murin fiable et reproductible de clampage hilaire du poumon gauche. Ce modèle implique une intervention chirurgicale réalisée sur une souris anesthésiée et intubée. Une thoracotomie gauche est pratiquée, suivie d’une mobilisation pulmonaire soigneuse et d’une dissection du hile pulmonaire gauche. La pince hilaire implique une ligature de suture réversible du hile pulmonaire avec un nœud coulant, qui arrête l’entrée artérielle, l’écoulement veineux et le flux d’air à travers la bronche principale gauche. La reperfusion est initiée par un retrait soigneux de la suture. Notre laboratoire utilise 30 min d’ischémie et 1 h de reperfusion pour le modèle expérimental dans les investigations actuelles. Cependant, ces périodes peuvent être modifiées en fonction de la question expérimentale spécifique. Immédiatement avant le sacrifice, des gaz sanguins artériels peuvent être obtenus du ventricule gauche après une période de 4 minutes de clampage hilaire droit pour s’assurer que les valeurs de PaO₂ obtenues sont attribuées au poumon gauche blessé seul. Nous décrivons également une méthode pour mesurer l’extravasation cellulaire par cytométrie en flux, qui implique l’injection intraveineuse d’un anticorps marqué au fluorochrome spécifique de la ou des cellules à étudier avant le sacrifice. Le poumon gauche peut ensuite être prélevé pour la cytométrie en flux, l’immunohistochimie congelée ou fixe, l’immunohistochimie intégrée à la paraffine et la réaction en chaîne quantitative par polymérase. Cette technique de clamp hilaire permet d’étudier en détail les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’IRI. Les résultats représentatifs révèlent une diminution de l’oxygénation du poumon gauche et des signes histologiques de lésions pulmonaires après clampage hilaire. Cette technique peut être facilement apprise et reproduite par le personnel avec ou sans expérience en microchirurgie, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et cohérents et de servir de modèle largement adoptable pour l’étude de l’IRI pulmonaire.

Introduction

L’IRI lors de la transplantation d’organe est un facteur de risque majeur de dysfonctionnement primaire du greffon et d’épisodes ultérieurs de rejet du greffon ^1,2. Au cours de la transplantation, le temps d’ischémie chaude est défini comme la période de temps entre la clampage aortique croisé du donneur et le début de la perfusion froide et entre le retrait de l’organe de la glace et l’implantation de l’organe. Le temps de stockage au froid est défini comme la période de temps entre le début de la perfusion froide et le retrait de l’organe de la glace³. L’ischémie chaude est plus délétère pour la fonction ultérieure des organes que l’ischémie froide ^4,5,6, et ses mécanismes sous-jacents justifient une étude plus approfondie dans des modèles précliniques. De plus, la transplantation d’organes par don après mort cardiaque (DCD) est associée à des temps ischémiques chauds plus longs que le don traditionnel après mort cérébrale (DBD)⁷. Bien que l’utilisation de donneurs de TDC puisse élargir le bassin de donneurs et augmenter l’utilisation des poumons, d’autres études précliniques sont nécessaires pour évaluer les effets de l’ischémie chaude sur la fonction pulmonaire post-greffe. Ci-dessous, nous décrivons un modèle d’IRI chaud chez la souris via la pince hilaire pulmonaire gauche.

Plusieurs modèles animaux de clampage hilaire pulmonaire ont été développés et adaptés au cours des dernières années et peuvent inclure l’utilisation d’un clamp microvasculaire atraumatique 8,9,10,11,12,13, d’un garrot de Rumel^14,15 ou d’une ligature de suture¹⁶ comme la pince hilaire. L’essentiel de la pince hilaire est qu’elle doit être réversible et causer peu ou pas de dommages aux structures hilaires afin que la reperfusion puisse être réalisée. Ici, nous décrivons notre technique de clamp hilaire chez la souris qui consiste en une ligature de suture réversible du hile pulmonaire gauche avec un nœud coulant. Cette méthode obstrue l’entrée artérielle pulmonaire, l’écoulement veineux et le flux d’air entrant et sortant de la bronche principale. Le principal avantage d’un noeud coulant par rapport à une pince vasculaire, un clip ou un garrot est que la poitrine peut être fermée pendant des périodes prolongées d’ischémie, minimisant ainsi la perte de liquide insensible et de chaleur chez la souris. Nous fournissons un protocole pour obtenir des mesures fiables des gaz du sang artériel (ABG) et pour mesurer l’extravasation cellulaire après le clampage hilaire.

Cette technique de clamp hilaire occupe une place importante dans l’étude plus large de la transplantation pulmonaire. Par rapport aux modèles animaux de transplantation pulmonaire orthotopique, la technique de clamp hilaire peut isoler les effets de l’IRI sans l’ajout d’un traumatisme anastomotique chirurgical ou d’une allogénicité¹⁷. De plus, la technique de la pince hilaire peut être maîtrisée plus facilement et plus rapidement que la greffe de poumon de souris. En fait, en utilisant des techniques de pince hilaire, plusieurs mécanismes importants dans la pathogenèse de l’IRI ont été identifiés au cours de la dernière décennie, tels que TLR4, NADPH oxydase et le récepteur^de l’adénosine A2A 14,18,19,20. Dans le protocole suivant, nous présentons une méthode fiable, enseignable et reproductible de clampage hilaire comme outil pour étudier l’IRI pulmonaire.

Protocole

Toutes les études ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de la faculté de médecine de l’Université de Washington. Les animaux ont reçu des soins sans cruauté conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, 8^e édition²¹ préparé par la National Academy of Sciences et publié par les National Institutes of Health, et aux Principes de soins aux animaux de laboratoire formulés par la National Society for Medical Research.

1. Anesthésie et intubation

1. Sélectionnez une souris qui pèse au moins 25 g. Cela facilitera l’intubation en raison de l’orifice plus grand entre les cordes vocales.
2. Injecter à la souris par voie intrapéritonéale un mélange de kétamine (dose de 100 mg/kg de poids corporel) et de xylazine (dose de 10 mg/kg de poids corporel). Ce mélange doit être chargé dans une seringue de 1/2 cc avec une aiguille de 1/2 pouce 29G. Attendez environ 5 minutes pour que la kétamine fasse effet - la souris ne doit pas présenter de mouvement spontané et ne répond pas à un pincement des orteils, ce qui confirme une anesthésie adéquate.
3. Injecter de la buprénorphine (dose de 0,05 mg/kg de poids corporel) par voie sous-cutanée avant la chirurgie pour un contrôle supplémentaire de la douleur.
4. Appliquez une pommade ophtalmique non médicamenteuse sur les deux yeux pour éviter la dessiccation de la cornée pendant la chirurgie.
5. Rasez la souris avec une tondeuse sur la poitrine gauche et le dos (voir Figure 1A), en étendant sur l’abdomen si une laparotomie est prévue (voir étape 5.3).
6. Une fois la souris anesthésiée, effectuez l’intubation à l’aide d’une configuration d’intubation préférée et le reste de la procédure sous un microscope sur un tapis chauffé à ~37 °C (pour maintenir la normothermie chez la souris).
7. Après avoir obtenu une vue adéquate des cordes vocales, insérez un introducteur fait maison (voir figure supplémentaire 1) avec une courbe à l’extrémité dans un angiocathéter 20G de 1 pouce, qui est utilisé comme tube endotrachéal (ETT). Guidez la pointe de l’introducteur, puis l’ETT entre et au-delà des cordes vocales.
   REMARQUE : Il est important de visualiser l’ETT passant par les cordes vocales pour éviter une fausse intubation dans l’œsophage. Il faut prendre soin d’éviter de blesser les cordes vocales pendant l’intubation (c.-à-d. que le nombre de tentatives d’intubation doit être limité à 5 et que l’ETT ne doit pas être avancée si une résistance est rencontrée).
8. Une fois l’ETT inséré, retirez l’introducteur et connectez l’ETT à un ventilateur pour petits animaux. Observez l’élévation symétrique de la poitrine pour confirmer l’intubation endotrachéale correcte. Les réglages du ventilateur doivent être de 100 à 105 respirations par minute et une fraction d’oxygène inspiré de 100 %. Le volume courant est de 0,35 mL et la pression positive en fin d’expiration est de 1 cm H₂O.
   REMARQUE : Assurez-vous que la poitrine plutôt que l’abdomen se soulève, car une intubation œsophagienne accidentelle entraînera la mort si elle n’est pas corrigée rapidement.
9. Une fois qu’il est en place, fixez l’ETT avec une bande de 5 cm de ruban de soie de 1 pouce autour du nez de la souris, en assurant un contact adéquat avec l’ETT et le nez afin que l’ETT ne glisse pas hors de la bouche (voir Figure 1B-C).
10. Pour maintenir une anesthésie adéquate tout au long de la chirurgie, administrez de l’isoflurane de 1 % à 1,5 % en ligne avec le débit d’oxygène.

2. Thoracotomie

1. Placez la souris en position de décubitus latéral droit, avec les deux pattes avant collées dans le coin supérieur gauche, la patte arrière droite collée dans le coin inférieur gauche et la patte arrière gauche collée dans le coin inférieur droit (voir la figure 2G pour le ruban adhésif).
2. Désinfecter avec la peau sur le thorax gauche avec au moins 3 cycles alternés de povidone iodé suivis d’une application d’alcool à 70%.
3. Effectuez une incision sur le 4^e espace intercostal de la ligne axillaire antérieure à la ligne axillaire postérieure, à l’aide de ciseaux pour ouvrir la peau sus-jacente (voir Figure 2A). Le 4e^{espace intercostal} est situé à environ 1 cm sous l’aisselle sur la ligne axillaire médiane.
4. Pour minimiser la perte de sang, coagulez les vaisseaux sanguins visibles dans les couches sous-cutanées et musculaires à l’aide d’un stylo cautérisé portatif.
5. Divisez nettement les muscles grand dorsal et dentelé antérieur à l’aide de ciseaux sur toute la longueur de l’incision cutanée (voir figure 2B).
6. À l’aide d’une pince fine incurvée, élevez soigneusement la 4^e côte (en prenant soin de ne pas blesser le poumon sous-jacent) et faites une incision précise avec des ciseaux fins juste au-dessus de la 5^e côte pour entrer dans la 4^e côte (voir figure 2C). Effectuez la thoracotomie au-dessus de la 5^e côte plutôt qu’en dessous de la 4^e côte pour éviter de blesser le faisceau neurovasculaire intercostal.
7. Une fois que la pression négative de la cavité pleurale est perdue et que le poumon se rétracte de la paroi thoracique, étendez la thoracotomie vers l’avant et vers l’arrière dans le 4^e espace intercostal juste au-dessus de la 5^e côte (voir Figure 2D-E). La longueur totale de l’incision doit être suffisamment longue pour exposer l’ensemble du poumon, généralement ~1 cm.
   REMARQUE : Un saignement interne de l’artère mammaire peut se produire si la thoracotomie est prolongée trop loin vers l’avant - le cas échéant, elle doit être cautérisée pour éviter une perte de sang excessive.
8. Appliquer deux écarteurs de nervures pour ouvrir l’espace thoracique, ce qui permet une fenêtre de travail d’au moins 1^cm2 pour une visualisation adéquate (voir la figure 2F-G).

3. Application de la pince hilaire

1. À l’aide d’applicateurs à deux pointes à bout de coton, mobiliser le poumon gauche en l’élevant en céphalade puis en divisant brusquement le ligament pulmonaire inférieur translucide (voir Figure 3A-B).
   REMARQUE : Si cela est difficile à réaliser sans déchirer le poumon, le ligament pulmonaire inférieur peut également être divisé brusquement à l’aide de ciseaux fins.
2. Réfléchissez le poumon vers l’avant afin que le hile pulmonaire postérieur gauche puisse être visualisé. Coupez un morceau de cravate en soie 6-0 à ~10 cm et placez le point médian de cette cravate derrière le hile (voir Figure 3C).
3. Ensuite, retournez le poumon gauche vers l’arrière pour reposer sur l’attache et tirez les deux extrémités de l’attache vers l’avant (voir la figure 3D).
4. Avec les deux extrémités libres (A et B) de l’attache, faites un nœud coulant réversible à l’aide d’une pince et d’une pince à moustiques incurvée. Voir la description détaillée aux étapes 3.4.1 et 3.4.2. Le temps ischémique chaud commence dès la réalisation du nœud coulant. Le poumon gauche ne doit plus se gonfler à chaque respiration du ventilateur une fois le nœud noué. Il doit devenir blanc pâle, ce qui signifie l’arrêt de la perfusion.
   REMARQUE : Il faut veiller à ce que le nœud se trouve au milieu du hile, en évitant de coincer par inadvertance l’oreillette gauche au centre et le parenchyme pulmonaire latéralement (voir Figure 3F).
   1. Avec la pince dans la main dominante et la pince dans la main non dominante, tenez l’extrémité de A avec une pince et enroulez une fois le point médian de A autour de la pince fermée (voir Figure 3E).
   2. Saisissez le point médian de B avec la pince et tirez à deux mains pour serrer le nœud coulant. Ne laissez pas l’extrémité de B passer à travers le nœud, ce qui rendrait le nœud irréversible. Après avoir fait le nœud, B doit avoir une boucle émanant du nœud, tandis que A doit être droit (voir Figure 3F). Le nœud peut être libéré en tirant sur l’extrémité de B.
5. Confirmez l’occlusion adéquate de la bronche en occlusant manuellement la tubulure d’évacuation de l’ETT au ventilateur, ce qui devrait empêcher le poumon gauche de se gonfler (voir Figure 3G). L’occlusion vasculaire est supposée avec l’occlusion bronchique étant donné la collapsibilité accrue de l’artère et des veines pulmonaires par rapport à la bronche cartilagineuse.
6. Après l’application de la pince hilaire, fermez l’incision cutanée avec un simple point interrompu à l’aide d’une suture en nylon 6-0, afin de minimiser les pertes de liquide insensible pendant la période d’ischémie chaude.

4. Libération de la pince hilaire

1. Après la période souhaitée d’ischémie chaude, relâchez le nœud coulant en tirant doucement sur l’extrémité libre courte de l’attache en soie (B de la figure 3F et de l’étape 3.4). Commencer le temps de reperfusion dès la libération du nœud coulant.
   REMARQUE : Après le relâchement de l’attache, la ventilation pulmonaire peut être confirmée par une nouvelle occlusion manuelle de l’écoulement de l’ETT, ce qui devrait maintenant provoquer une expansion du poumon gauche. Encore une fois, la perfusion est impliquée avec l’inflation du poumon, cependant, elle peut également être confirmée par le rosissement du poumon (voir Figure 4A).
2. Pendant la période de reperfusion, fermez le thorax en trois couches pour minimiser les pertes insensibles. Tout d’abord, fermez l’espace de la 4^e côte avec un point unique avec une suture en nylon 6-0, avec une morsure juste au-dessus de la 4^e côte et une morsure juste au-dessus de la 6^e côte (voir Figure 4B-C). Attachez-le au gonflage pulmonaire maximal, afin de minimiser le risque de pneumothorax iatrogène (voir Figure 4D-E).
3. Ensuite, fermez la couche musculaire à l’aide d’un simple point de couture avec une suture en nylon 6-0.
4. Enfin, fermez l’incision cutanée à l’aide d’un simple point interrompu avec une suture en nylon 6-0 (voir figure 4F). Évitez de faire couler des points de suture sur la peau en raison du risque que des animaux éveillés se grattent leur incision et entraînent une déhiscence complète de la plaie.
5. À partir de ce moment, le poumon peut être directement prélevé à la fin du temps de reperfusion souhaité. Si vous souhaitez une évaluation ABG, reportez-vous à l’étape 5. Si une injection intraveineuse supplémentaire est souhaitée avant le sacrifice, voir l’étape 6. Il s’agit d’une chirurgie terminale.
6. Si le temps de reperfusion est prévu pour être supérieur à quelques heures, éteignez l’isoflurane pour permettre à la souris de se réveiller de l’anesthésie et d’extuber. Les critères d’extubation comprennent des contractions avec pincement de la patte et des respirations et mouvements spontanés. Le réveil d’une souris sous anesthésie à la kétamine et à l’isoflurane prend généralement 30 à 45 minutes. Il s’agit d’une chirurgie de survie.
   1. Pour une chirurgie de survie, injecter 1 mL de solution saline chaude par voie sous-cutanée pour tenir compte des pertes de liquide dues à la chirurgie. Injecter de la buprénorphine (dose de 0,05 à 0,1 mg/kg de poids corporel) par voie sous-cutanée avant la chirurgie pour contrôler la douleur. Répétez l’anesthésie toutes les 4 à 6 heures pendant au moins 3 jours après la chirurgie. Envisagez un bloc de bupivacaïne le long de l’incision pour un contrôle supplémentaire de la douleur.

5. Évaluation ABG

REMARQUE : Si une mesure de l’ABG est souhaitée, il est préférable de l’obtenir par aspiration sanguine artérielle à partir du ventricule gauche. Pour s’assurer que l’ABG ne reflète que la fonction pulmonaire gauche, ce sang artériel doit être prélevé après environ 4 minutes de clampage du hile droit^22,23, pendant laquelle seul le poumon gauche effectue l’oxygénation et la ventilation.

1. Si la souris a été réveillée de l’anesthésie après la clamp hilaire, anesthésie à nouveau et intubez la souris selon l’étape 1.
2. Environ 15 à 20 minutes avant la fin du temps de reperfusion souhaité, positionnez la souris en position couchée, en fixant les quatre membres avec du ruban adhésif.
   REMARQUE : Il faut prévoir suffisamment de temps pour que les étapes suivantes soient effectuées avant la fin de la reperfusion. Le moment précis de l’ouverture de l’abdomen et de la poitrine variera en fonction du chirurgien et de son expérience.
3. Effectuer une laparotomie médiane de l’os pubien à la xiphoïde, en incisant avec des ciseaux la peau suivie de la paroi abdominale le long de la linea alba (voir Figure 5A-B).
4. Au niveau de la xiphoïde, étendre la laparotomie à gauche et à droite jusqu’à la ligne axillaire antérieure, en suivant la courbe de la côte la plus inférieure (voir Figure 5C).
5. À partir de l’abdomen, incisez le diaphragme antérieur sur la ligne médiane pour pénétrer dans le thorax en prenant soin de ne pas aller trop profondément pour éviter de blesser le cœur (voir Figure 5D-E). Ensuite, étendez l’incision du diaphragme antérieur à gauche et à droite jusqu’à la ligne axillaire antérieure, le long de la côte la plus inférieure (voir ligne pointillée blanche sur la figure 5D).
6. Divisez les côtes bilatérales le long de la ligne axillaire antérieure, en s’étendant vers le haut vers l’aisselle, pour créer une thoracotomie à clapet. Ensuite, réfléchissez la paroi thoracique antérieure (sternum et côtes antérieures bilatérales) céphalade, ce qui permet une exposition complète du cœur et des poumons bilatéraux (voir les lignes pointillées blanches sur la figure 5F).
7. Appliquez une pince sur la paroi thoracique antérieure qui est retournée pour faciliter la rétraction. Rétractez le diaphragme vers le bas à l’aide d’une pince anti-moustique incurvée sur la ligne médiane pour améliorer la visualisation de la poitrine (voir Figure 5F).
8. Pour mobiliser complètement le poumon droit (qui a 4 lobes), renvoyez le lobe accessoire qui s’étend au-delà de la ligne médiane dans le thorax gauche et dans le thorax droit (voir la figure 5G-H). Il y a un ligament mince qui attache ce lobe à la poitrine gauche - divisez-le soit brusquement avec des applicateurs à pointe de coton, soit nettement avec des ciseaux.
   REMARQUE : Ce lobe accessoire traverse la ligne médiane postérieure à la veine cave inférieure (IVC), il faut donc veiller à ne pas blesser l’IVC pendant cette manœuvre.
9. Une fois que tous les lobes sont ramenés vers la poitrine droite, réfléchissez l’ensemble du poumon droit vers l’avant et placez une autre cravate de soie 6-0 (coupée à ~10 cm) derrière le hile droit. Ensuite, replacez le poumon droit dans la poitrine par-dessus l’attache.
10. Faites un autre nœud coulant autour du hile droit en utilisant la même technique que celle décrite à l’étape 3.4, en prenant soin d’entourer les quatre lobes du poumon droit. Cette étape de clamp hilaraire droite doit être chronométrée à environ 4 minutes avant la fin de la reperfusion.
11. Enduisez une aiguille 31G de 1/2 pouce sur une seringue à tuberculine de 1 cc avec environ 200 μL d’héparine 1000 unité/ml. Pour ce faire, aspirez le volume d’héparine et tirez à plusieurs reprises le piston d’avant en arrière 3 à 4 fois pour permettre à l’héparine d’enrober tout l’intérieur de la seringue. Ceci est fait pour minimiser le risque de coagulation du sang aspiré pendant le transport du poste chirurgical à l’appareil ABG .
12. Après 4 min de clampage hilaire droit, aspirez le sang artériel du ventricule gauche dans la seringue enrobée d’héparine (voir Figure 5I). Veillez à éviter de perforer le septum ventriculaire et d’aspirer par inadvertance le sang ventriculaire droit veineux. Il y a une nette différence de couleur entre le ventricule droit plus foncé et le ventricule gauche plus clair (voir figure 5I en médaillon). Inclinez l’aiguille vers le cou gauche. Plusieurs ponctions peuvent être nécessaires pour obtenir suffisamment de sang pour faire couler un ABG (~150 μL).
    REMARQUE : Pendant les 4 minutes de pince hilaire droite, la souris peut commencer à présenter une respiration agonale qui annonce une mort imminente. Si cela se produit, le sang artériel doit être aspiré rapidement avant l’arrêt cardiaque. Il n’est pas possible d’aspirer le sang d’un cœur qui ne bat pas.
13. Faites passer le sang artériel sur une machine ABG pour obtenir la saturation en oxygène, la pression partielle d’oxygène, la pression partielle de dioxyde de carbone, entre autres mesures. Euthanasier la souris après la collecte d’ABG et/ou le traitement par anticorps (voir étape 6).

6. Injection intraveineuse d’anticorps pour la mesure de l’extravasation cellulaire

REMARQUE : Cette technique peut être utilisée pour déterminer l’extravasation cellulaire par injection intraveineuse d’anticorps marqués au fluorochrome dans la VCI avant le sacrifice, suivie d’une analyse cytométrique en flux, comme publié précédemment¹⁸. En bref, les neutrophiles intravasculaires peuvent être distingués des neutrophiles interstitiels à l’aide d’anticorps anti-Ly6G spécifiques des neutrophiles. L’anti-Ly6G marqué à la fluorescéine isothiocyanate (FITC-marked) (clone 1A8) est injecté par voie intraveineuse 5 minutes avant le sacrifice, ce qui permet de marquer les neutrophiles intravasculaires circulants. La concentration de l’anticorps FITC-Ly6G utilisée est de 100 ng dilués dans 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate. Ensuite, après la préparation d’une suspension unicellulaire à partir du poumon gauche pour la cytométrie en flux, tous les neutrophiles sont marqués avec l’anti-Ly6G marqué à l’allophycocyanine (APC) (clone 1A8). Ainsi, les neutrophiles APC-Ly6G⁺FITC-Ly6G⁺ sont intravasculaires tandis que les neutrophiles APC-Ly6G⁺FITC-Ly6G^- sont extravasculaires ou interstitiels. Cette technique peut être adaptée aux monocytes avec des anticorps anti-Ly6C, aux lymphocytes B avec des anticorps anti-CD19, par exemple.

1. Chargez l’anticorps souhaité dans une seringue de 3/10 cc avec une aiguille 31G de 5/16 de pouce, en prenant soin de minimiser les bulles d’air à l’intérieur de la seringue. Utilisez-le pour l’injection intraveineuse dans la VCI à l’étape 6.5.
2. Effectuez la laparotomie selon les étapes 5.3-5.4.
3. Après la laparotomie, effectuez une rotation viscérale médiale droite à l’aide de deux applicateurs à pointe de coton. Chez une souris, cela se fait en éviscérant tout l’intestin à gauche de l’abdomen, ce qui permettra une vue claire de la VCI (voir Figure 6A).
4. Nettoyez la graisse qui recouvre l’IVC avec des applicateurs à embout de coton.
5. Injecter la solution d’anticorps dans la VCI par ponction veineuse (voir Figure 6B). Lors de l’extraction de l’aiguille, appliquez immédiatement une légère pression avec un coton-tige sur le site de la ponction veineuse jusqu’à ce qu’elle soit hémostatique (généralement environ 2-3 min).
6. Remettez l’intestin éviscéré dans l’abdomen au-dessus du coton-tige pour continuer à appliquer une pression sur la VCI (voir la figure 6C).
7. Effectuez une thoracotomie à clapet selon les étapes 5.5 à 5.7 pour prélever le poumon gauche. Laisser les anticorps circuler systématiquement pendant au moins 5 minutes avant le sacrifice et la récolte. Euthanasier la souris après la collecte d’ABG et/ou le traitement par anticorps.

7. Coloration histologique (H&E)

1. Après la fixation au formol et l’enrobage de paraffine du poumon gauche et la sectionnement à une épaisseur de 5 μm, déparaffiniser la lame dans du xylène (deux lavages de 10 minutes).
2. Déshydrater dans les lavages séquentiels à l’éthanol : 2 lavages de 5 minutes à 100 %, 1 lavage de 2 minutes à 95 % et 1 lavage de 2 minutes à 70 % d’éthanol. Ensuite, rincez à l’eau déminéralisée.
3. Teintez la lame avec de l’hématoxyline pendant 2 à 4 minutes, puis lavez-la à l’eau déminéralisée pendant 5 minutes ou jusqu’à ce qu’elle soit claire. La durée précise de la coloration à l’hématoxyline devra être optimisée en fonction du tissu et de l’intensité de coloration nucléaire souhaitée.
4. Laver dans une solution de définition pendant 30 s pour différencier les taches, puis laver à l’eau pendant 2 min. Laver dans une solution de formation de couleur bleue pendant 30 s, puis laver à l’eau pendant 2 min.
5. Déshydratez davantage en trempant 15 fois plus d’éthanol à 95 %. Colorer à l’éosine pendant 1 min.
6. Déshydrater avec 2 min de lavage à l’éthanol (2x), suivi de 2 min de lavage au xylène (2x). Appliquez le support de montage et la lamelle.

Résultats

Après clampage hilaire gauche, la pression partielle d’oxygénation dans le sang artériel (PaO₂) attribuée au poumon gauche est de ~100 mmHg, significativement plus faible par rapport aux ~500 mmHg après thoracotomie simulée (Figure 7A, n = 6-7). Il convient de noter que des thoracotomies simulées ont été réalisées chez des souris B6 avec une mesure ABG prise après 4 minutes de clampage hilaire droit, représentant des valeurs attribuées au poumon gauche seul. La col...

Discussion

Nous décrivons une technique de clamp hilaire qui implique l’application d’un nœud coulant sur le hile gauche qui obstrue l’artère et les veines pulmonaires et les bronches pour induire une ischémie chaude suivie d’une reperfusion. Après le clampage hilaire, le poumon gauche peut être prélevé pour diverses techniques expérimentales telles que l’histologie, la cytométrie en flux, le séquençage en vrac ou sur cellule unique et la réaction en chaîne quantitative par polymérase. De plus, le sang et l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection