Isolement de cellules gliales gliales rétiniennes primaires de souris

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour isoler les cellules gliales rétiniennes de Müller des yeux de souris. Le protocole commence par l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules de Müller.

Résumé

La principale cellule de soutien de la rétine est la cellule gliale de Müller. Ils couvrent toute la surface de la rétine et se trouvent à proximité des vaisseaux sanguins de la rétine et des neurones rétiniens. En raison de leur croissance, les cellules de Müller effectuent plusieurs tâches cruciales dans une rétine saine, notamment l’absorption et le recyclage des neurotransmetteurs, des composés de l’acide rétinoïque et des ions (comme le potassium K+). En plus de réguler le flux sanguin et de maintenir la barrière hémato-rétinienne, ils régulent également le métabolisme et l’apport de nutriments à la rétine. Une procédure établie pour isoler les cellules primaires de Müller de souris est présentée dans ce manuscrit. Pour mieux comprendre les processus moléculaires sous-jacents impliqués dans les différents modèles murins de troubles oculaires, l’isolement cellulaire de Müller est une excellente approche. Ce manuscrit décrit une procédure détaillée pour l’isolement des cellules de Müller chez la souris. De l’énucléation à l’ensemencement, l’ensemble du processus dure environ quelques heures. Pendant 5 à 7 jours après l’ensemencement, le substrat ne doit pas être changé afin de permettre aux cellules isolées de se développer sans entrave. La caractérisation cellulaire à l’aide de la morphologie et de marqueurs immunofluorescents distincts vient ensuite dans le processus. Le nombre maximum de passages pour les cellules est de 3 à 4 fois.

Introduction

Les cellules de Müller (MC) sont les cellules gliales principales et les plus abondantes présentes dans le tissu rétinien. Ils sont les acteurs clés de l’intégrité structurelle et des fonctions métaboliques au sein de la rétine¹. La structure stratégique des MC est répartie sur toute l’épaisseur de la rétine, fournissant ainsi un soutien à la rétine. En plus de leurs propriétés d’échafaudage, ils ont des fonctions métaboliques pour les neurones rétiniens, leur fournissant des substrats énergétiques, notamment le glucose et le lactate. Ces fonctions sont cruciales pour maintenir une fonction neuronale saine. Il a été rapporté que les MC altérés contribuent à diverses maladies rétiniennes, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinopathie diabétique et le glaucome ^2,3. Les MC peuvent être des sources cellulaires endogènes pour la thérapie régénérative dans la rétine¹. Elles comprennent également une partie importante de la rétine, et des preuves solides suggèrent que chez plusieurs espèces, ces cellules peuvent être stimulées pour remplacer les neurones manquants². Ils collaborent avantageusement avec les neurones, et les extrémités des cellules de Müller à ramification conique dégainent densément les vaisseaux sanguins et relient les composants neuronaux de la rétine. Afin de maintenir le développement neuronal et la plasticité neuronale, les cellules de Müller agissent comme un substrat mou pour les neurones, les protégeant des traumatismes mécaniques³. De plus, dans des circonstances pathologiques, les cellules de Müller peuvent se différencier en progéniteurs neuraux ou en cellules souches qui répliquent ou régénèrent les photorécepteurs et les neurones perdus ^2,3,4. Les cellules de Müller conservent les caractéristiques des cellules souches rétiniennes, y compris différents niveaux de potentiel d’auto-renouvellement et de différenciation ^5,6. La cellule gliale de Müller possède une lignée rétinienne significative qui produit des facteurs neurotrophiques, absorbe et recycle les neurotransmetteurs, tamponne spatialement les ions et maintient la barrière hémato-rétinienne afin de maintenir la rétine en homéostasie ^7,8,9. Cela met en évidence le potentiel des cellules de Müller en tant qu’outil prometteur dans les thérapies cellulaires pour traiter les maladies liées à la dégénérescence rétinienne. Les cellules de Müller sont les cellules gliales primaires réparties dans toute la rétine, se connectant à la fois aux neurones et aux vaisseaux sanguins. Ils jouent un rôle protecteur crucial, fournissant un soutien structurel et métabolique essentiel pour maintenir la viabilité et la stabilité des cellules rétiniennes. Malheureusement, très peu de protocoles sont trouvés dans la littérature pour l’isolement des cellules primaires de Müller de la rétine^10,11.

Nous présentons une approche améliorée pour isoler et cultiver de manière fiable des cellules primaires de Müller de souris. Ce protocole a été utilisé dans notre groupe pour isoler les cellules de Müller des souris C57BL/6 de type sauvage et des souris transgéniques ^12,13. Des souris âgées de 5 à 11 jours, sans préférence sexuelle, sont utilisées pour ce protocole. Les cellules ont été traversées jusqu’à 4 fois ; cependant, à P4, ils cessent d’adhérer au ballon et il devient difficile de cultiver une culture saine. La culture est souvent contaminée par des cellules épithéliales pigmentées rétiniennes (EPR), de sorte que les cellules doivent être passées au moins une fois avant d’effectuer des expériences supplémentaires sur la lignée cellulaire. Le passage permet une meilleure isolation des contaminants. Par conséquent, le protocole présenté offre un moyen rapide et efficace d’isoler les cellules de Müller de souris, qui peuvent ensuite être utilisées comme une plate-forme fiable pour rechercher des cibles thérapeutiques et évaluer des traitements potentiels pour les maladies de la rétine¹⁴.

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Protocole

Toutes les expériences sur des animaux étaient conformes à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et ont été réalisées conformément à notre protocole sur les animaux approuvé par le comité de l’Institute for Animal Care and Use (IACUC) et aux politiques de l’Université d’Oakland (numéro de protocole 2022-1160)

1. Préparation du milieu et de la solution

1. Préparez la solution oculaire à cellules de Müller en complétant le milieu Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, détails dans le tableau des matériaux) avec de la pénicilline/streptomycine à la dilution de 1:1000. Par exemple, pour 10 ml de DMEM, ajoutez 10 μL de pénicilline/streptomycine.
   REMARQUE : Il s’agit d’un simple milieu sans sérum préparé. Réchauffez également l’ensemble du milieu dans un bain-marie à 37 °C avant de l’utiliser pour des travaux de culture cellulaire.
2. Préparez un milieu de croissance cellulaire primaire complet en complétant le DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS, inactivé par la chaleur) et 1 % de pénicilline/streptomycine. Par exemple (500 ml de média DMEM + 50 ml de FBS + 5 ml de pénicilline/streptomycine).
3. Préparez une solution de trypsine-EDTA à 0,05 % avec de la collagénase IV à une concentration de 200 U/mL (la trypsine-EDTA est utilisée pour dissoudre la quantité calculée de poudre de collagénase IV afin d’atteindre la concentration nécessaire).

2. L’énucléation

1. Euthanasier éthiquement la souris en utilisant l’inhalation de CO₂ conformément aux directives de l’IACUC.
   1. Brièvement, placez le ou les animaux dans la chambre de CO₂ pour introduire 100 % de CO₂ à un taux de remplissage de 30 à 70 % de la chambre vol/min avec du CO₂ afin d’atteindre l’objectif d’une perte de conscience rapide en 2 à 3 minutes avec une détresse minimale pour les souris.
   2. Étant donné que les souris sont à un jeune âge (~10 jours), effectuez une luxation cervicale comme méthode secondaire pour assurer une euthanasie appropriée.
2. Après avoir stérilisé la zone de travail avec de l’éthanol à 70 %, placez la souris sur un sous-tampon stérile.
3. Extrayez les yeux en plaçant les bras de la pince à épiler à l’arrière de l’œil, en tirant doucement sur la zone orbitaire et en isolant les yeux en appliquant une pression avec une pince à épiler de style 5/45 sur la zone orbitaire pour provoquer une proptose.
   REMARQUE : Stérilisez les outils de dissection avec de l’éthanol à 70% suivi d’une solution saline tampon phosphate avant la dissection.
4. Assurez-vous que le nerf optique est toujours connecté à l’œil en incubant lentement l’œil. Assurez-vous de tirer le nerf optique (identifié visuellement comme un cordon blanc) derrière l’œil.
   REMARQUE : Cette étape n’a pas besoin d’être effectuée au microscope et peut être effectuée sur une paillasse stérilisée.

3. Traitement des yeux énucléés

1. Couvrez un tube à centrifuger de 15 ml avec du papier d’aluminium et remplissez le tube avec 10 ml de la solution pour les yeux à cellules Müller.
2. Placez les yeux disséqués dans le tube de 15 mL contenant la solution pour les yeux à cellules de Müller et laissez-les reposer toute la nuit, soit environ 18 h, à température ambiante.
3. Après 18 h, décantez la solution pour les yeux et rincez-les brièvement avec 2 à 3 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) réchauffée (37 °C).
4. Décantez le PBS et placez les yeux dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant 10 ml de solution de trypsine. (préparé à l’étape 1.3).
   REMARQUE : La trypsine est utilisée sur l’ensemble de l’œil énucléé, agissant comme un agent dissociatif pour faciliter la séparation cellulaire des couches rétiniennes pendant la dissection. La rétine disséquée contient de nombreuses cellules, y compris des cellules EPR, qui sont collantes et sont les plus susceptibles de contaminer la culture cellulaire de Müller¹⁴. L’examen microscopique a clairement montré qu’après 5 jours d’isolement (lors du premier changement de milieu), les cellules EPR se sont détachées de la plaque et sont mortes¹³. Le milieu utilisé pour l’isolement de l’EPR est le DMEM/F-12, avec une composition différente de celle du DMEM (utilisé dans l’isolement des cellules de Müller), contenant du pyruvate de sodium et une faible teneur en glucose.
5. Placez le plat dans un incubateur et incubez pendant 1,5 à 2 h à 37 °C et 5% de CO₂.
6. Après l’incubation, transférez les yeux dans une boîte de Pétri de 60 mm contenant environ 5 ml de milieu de croissance cellulaire primaire Müller complet.

4. Dissection

REMARQUE : Cette procédure doit être effectuée dans l’environnement stérile de la hotte de culture. Par conséquent, il est essentiel de stériliser soigneusement les surfaces de la hotte avec de l’alcool à 70%, ainsi que tous les outils et le microscope de dissection. Il convient de noter que la vidéo a été enregistrée à l’extérieur du capot pour une meilleure visibilité et des démonstrations plus claires.

1. Placez un petit morceau de tissu de laboratoire stérilisé dans la boîte pour aider à stabiliser les yeux pendant la dissection. Placez les yeux sous un microscope à dissection pour commencer la dissection.
   REMARQUE : L’utilisation de tissu de qualité laboratoire facilite la manœuvre des yeux dans une boîte remplie de liquide (milieu complet), assurant une dissection précise.
2. Utilisez des ciseaux Vannas et une pince à épiler de type M5S pour enlever le tissu conjonctif, les muscles extraoculaires et le nerf optique.
   1. Saisissez l’œil avec une pince à épiler de style M5S et faites une incision dans la section ora serrata avec des ciseaux Vannas ou une aiguille de seringue.
      REMARQUE : Il y a une ligne circulaire bleu clair entre la partie antérieure et postérieure de l’œil appelée ora serrata, qui peut être utilisée comme point de repère pour une direction précise pendant la dissection.
   2. Saisissez l’incision à l’aide d’une pince à épiler de type M5S et tirez ou déchirez la cornée de la partie postérieure de l’œil. Tirez par petits incréments pour vous assurer que l’intégrité de la rétine reste intacte.
      REMARQUE : Ces étapes consistent à retirer la partie antérieure de l’œil (cornée, iris et cristallin) de la partie postérieure de l’œilleton (rétines neurales et pigmentées).
   3. Pour maintenir l’intégrité des couches rétiniennes, tirez doucement et retirez l’épithélium pigmenté rétinien de la rétine neurale. La rétine neurale doit être exempte de toute tache noire pour assurer autant que possible la pureté de l’isolement, car la couche RPE est généralement collante et attachée à la rétine neuronale.
   4. Coupez la rétine neurale disséquée en petits morceaux avant de la rassembler dans une plaque pour assurer une répartition homogène des cellules sur la plaque.
3. Placez les rétines neurales dans une fiole T25 contenant 4 mL de milieu de croissance cellulaire primaire Müller complet.
4. Enfin, placez le ballon dans un incubateur et incubez à 37 °C et 5 % de CO₂.

5. Culture de cellules gliales primaires de Müller

1. Ne déplacez pas le flacon pendant 3 à 5 jours pour favoriser la croissance cellulaire.
2. Changez de milieu après le cinquième jour et tous les deux jours par la suite jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 90 %.

6. Passage des cellules gliales primaires de Müller

1. Aspirer le milieu de culture cellulaire Müller, puis appliquer 2 mL de lavage dans du PBS et aspirer le PBS. Ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % (1x), ou assez pour couvrir l’assiette.
2. Incuber pendant 5 à 10 minutes à température ambiante.
3. Assurez-vous que les cellules sont détachées de la plaque au microscope. Ensuite, prélever la suspension cellulaire et ajouter 4 ml de milieu de croissance cellulaire primaire Müller complet préchauffé (37 °C) (préparé à l’étape 1.2) dans le tube de prélèvement.
4. Centrifugeuse pendant 7 min à 300 x g. Après avoir aspiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 10 mL de milieu de croissance cellulaire primaire Müller complet. Étant donné que le nombre de cellules peut varier en fonction du nombre d’yeux disséqués, il est donc préférable de compter les cellules avant l’ensemencement et l’incubation. La densité de semis recommandée est de 3,0 x 10⁶ cellules dans une fiole T75.
   REMARQUE : Les cellules peuvent être traversées jusqu’à 4-5 fois. Cependant, les résultats d’expérience les plus cohérents se trouvent après 1 à 2 passages.

7. Immunofluorescence

REMARQUE : Utilisez le protocole d’immunofluorescence pour colorer et valider la spécificité des cellules de Müller. Voici un bref aperçu du protocole d’immunofluorescence. Cette étape est effectuée après le premier passage¹².

1. Ensemencez les cellules dans une lame de chambre de culture cellulaire (30 000 cellules par puits pour une lame de chambre à 8 puits).
2. Cultivez les cellules isolées pendant 24 à 48 h dans un milieu de culture cellulaire Müller complet (préparé à l’étape 1.2) à 37 °C et 5 % de CO₂.
3. Aspirez le média et lavez la lame de la chambre avec 250-300 μL de 1x PBS sur chaque puits lorsque les cellules sont confluentes à 80-90%.
4. Fixez la lame pendant 10 à 15 minutes dans 250-300 μL de paraformaldéhyde à 4 % sur chaque puits, suivie d’un lavage avec PBS/TX-100 (5 min chacun/3x).
5. Ajouter un tampon de blocage pendant 1 h à 37 °C (voir le tableau des matériaux).
6. Aspirez la solution bloquante, puis ajoutez les anticorps primaires spécifiques des cellules de Müller pour confirmer la pureté des cellules isolées à l’aide de la glutamine synthétase et de la vimentine ^5,12. Incuber pendant 3 h à 37 °C (en utilisant une concentration d’anticorps de 1:100-1:200 dans un tampon de blocage dans un volume de 150-200 μL/lame). Lavez la diapositive avec des lavages PBS/TX-100 (5 et 10 min chacun).
   REMARQUE : Ces anticorps ont été choisis car ils sont caractéristiques de l’identification des cellules de Müller et de la garantie du succès et de la pureté de la culture de cellules de Müller.
7. Ajouter l’anticorps secondaire (avec une concentration d’anticorps allant de 1:1000 dans un tampon de blocage dans une lame de 150 à 200 μL) et incuber pendant 1 h à 37 °C. Ensuite, lavez avec PBS/Triton X-100, trois fois (5 à 10 minutes chacune).
8. Appliquez une goutte de support de montage DAPI pour étiqueter les noyaux avant de recouvrir la lame avec une lamelle. Évitez les bulles d’air lors de la mise en place de la lamelle.
9. Utilisez un microscope fluorescent pour vérifier la lame et capturer des images (voir la table des matériaux).
   REMARQUE : Les cellules sont localisées avec DAPI à ex/em 359/461 à un grossissement de 10x pour localiser les cellules ; Un grossissement plus élevé peut capturer des cellules. D’autres longueurs d’onde dépendraient de la couleur choisie. Couleur verte (GFP)- ex/em 488/510. Couleur rouge (Cy3)- ex/em 555/569.

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Résultats

Validation de la spécificité, de la pureté et de la fonction barrière des cellules de Müller isolées
Pour confirmer la viabilité, la morphologie et les qualités distinctives des cellules de Müller isolées, les cellules ont été examinées au microscope optique. Des images P0 et P1 ont été enregistrées (Figure 1A). Pour vérifier la contamination des cellules de Müller isolées par des cellules EPR et confirmer leur pureté, une coloration par immunofluoresc...

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Discussion

L’isolement de l’épithélium pigmenté rétinien primaire (EPR) chez la souris a déjà été documenté par notre laboratoire. Ce manuscrit décrit un protocole de démonstration détaillé pour l’isolement des cellules primaires de Müller. Cette procédure implique l’énucléation, le traitement, la dissection, la collecte, l’ensemencement, la culture et la caractérisation de cellules de Müller isolées dans des yeux de souris. Il est basé sur un protocole précédemment couronné de succès trouvé dans...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Beaker : 100mL	KIMAX	14000
Collagenase IV	Worthington	LS004188
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile		13-711-20
DMEM (1X)	Thermo Scientific	11885084	Media to grow Müller cells
Fetal Bovine Serum (FBS)	gibco	26140079	For complete Muller cell culture media
Glutamine synthase	Cell signalling	80636
Heracell VISO 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL	B-D	309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL	Grainger	11L819
Pen Strep	gibco	15140-122	For complete Müller cell culture media
Phosphate Buffer saline (PBS)	Thermo Scientific	J62851.AP
Positive Action Tweezers, Style 5/45	Dumont	72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm	GARANA INDUSTRIES	2595
Sorvall St8 Centrifuge	ThermoScientific	75007200
Stemi 305 Microscope	Zeiss	n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel	Bard-Parker	371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style	Corning	430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style	Corning	353003
Tornado Tubes: 15mL	Midsci	C15B
Tornado Tubes: 50mL	Midsci	C50R
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09x0.05mm Tips	Dumont	501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL	Electron Microscopy Sciences Dumont	50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36"	McKesson	4033
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	FST	15000-08
Vimentin	invitrogen	MA5-11883
Zeiss AxioImager Z2	Zeiss	n/a
Zeiss Zen Blue 2.6	Zeiss	n/a