Un modèle de xénogreffe organoïde dérivé d’un patient atteint d’un cancer hépatocellulaire pour étudier l’impact de la régénération hépatique sur la croissance tumorale

Résumé

Les organoïdes générés à partir des tumeurs des patients sont injectés orthotopiquement dans le foie de la souris. La résection du tissu hépatique non tumoral conduit à un environnement régénérateur dans le tissu hépatique où se trouve la tumeur.

Résumé

La récidive pose un défi notable après le traitement d’un carcinome hépatocellulaire (CHC), affectant plus de 70 % des patients qui subissent une résection chirurgicale. La récidive provient de micro-métastases non détectées ou d’un cancer de novo , potentiellement déclenché par une régénération hépatique postopératoire. Des recherches antérieures ont utilisé des lignées cellulaires CHC dans des modèles orthotopiques pour étudier l’impact de la régénération hépatique, mais leur validité limitée a suscité la nécessité d’un modèle plus représentatif. Ici, nous introduisons une nouvelle approche utilisant des organoïdes de CHC dérivés de patients pour étudier l’influence de la régénération hépatique sur le CHC.

Les tissus tumoraux des patients sont traités pour créer des organoïdes tumoraux, intégrés dans une matrice de membrane basale tridimensionnelle et cultivés dans un milieu spécifique au foie. Un million d’organoïdes sont injectés dans le lobe supérieur droit (RSL) de souris immunodéficientes, confirmant la croissance tumorale macroscopique par échographie. Le groupe d’intervention subit une résection du lobe latéral gauche (LLL) (30 % du volume total du foie) ou du lobe moyen (ML) (65 % du volume total du foie) pour induire une régénération hépatique au sein du site tumoral. Le groupe témoin subit une ré-laparotomie sans résection du tissu hépatique. Après 2 semaines, les deux groupes subissent une explantation de tumeur et de tissu normal.

En conclusion, ce modèle d’organoïde du CHC dérivé d’un patient offre une plate-forme robuste pour étudier l’impact de la régénération hépatique après la résection du cancer. Sa composition multicellulaire, sa diversité génétique et ses capacités de culture prolongée en font un outil inestimable pour étudier les mécanismes de récurrence du CHC et les interventions potentielles.

Introduction

La récidive après un traitement par carcinome hépatocellulaire (CHC) est un défi important, affectant plus de 70 % des patients subissant une résection chirurgicale ^1,2,3. Cette récidive peut résulter d’une micro-métastase non détectée (tumeur multicentrique) ou du développement d’un cancer de novo ⁴. Des études cliniques et expérimentales suggèrent que le processus de régénération hépatique déclenché par la résection chirurgicale pourrait activer des micro-métastases latentes, contribuant ainsi à la récidive tumorale.

D’autres recherches sont nécessaires pour comparer l’expression des gènes et des protéines dans les cellules hépatiques normales et malignes dans un environnement hépatique régénératif. En plus d’élucider les mécanismes sous-jacents à la récidive, l’identification de voies de signalisation ciblées spécifiques aux cellules cancéreuses offre un potentiel de progrès thérapeutiques substantiels. Cette approche vise à réconcilier les notions apparemment contradictoires d’un microenvironnement anti-tumoral et de conditions favorables à la régénération du foie.

Les modèles précédents ont utilisé l’injection orthotopique de lignées cellulaires CHC pour étudier l’impact de la régénération hépatique⁵. Ce modèle pionnier utilise des organoïdes de CHC dérivés de patients, offrant plusieurs avantages par rapport aux lignées cellulaires traditionnelles. Les organoïdes maintiennent des populations cellulaires diversifiées, reflétant la structure et la fonction du modèle, contrairement aux lignées cellulaires et aux sphéroïdes. Leur diversité génétique renforce la représentativité. De plus, les organoïdes offrent une stabilité pour une culture prolongée, ce qui permet des études d’intervention prolongées. Nous recommandons l’injection de RSL en raison de son potentiel de régénération supérieur par rapport au lobe inférieur droit (RIL). La méthode décrite ici fournit une plate-forme utilisant des organoïdes cancéreux présentant des avantages prononcés par rapport aux lignées cellulaires cancéreuses pour étudier la question de recherche susmentionnée.

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Protocole

Des échantillons de foie utilisés pour la génération d’organoïdes ont été prélevés sur des patients opérés à l’Hôpital universitaire de Bâle (USB) après consentement éclairé écrit sous approbation du Comité d’éthique de la Suisse du Nord-Ouest et centrale (numéro BASEC 2019-02118). Toutes les expériences sur les souris ont été approuvées et réalisées conformément aux directives et règlements de la Commission de protection des animaux du canton de Bâle-Ville, Suisse (3123-33896). Toutes les souris appartenaient à la souche gamma de souris SCID diabétique non obèse (NOD) et étaient donc génétiquement modifiées pour être immunodéprimées ; Seuls des animaux mâles ont été utilisés. Voir le Tableau 1 et le Tableau des matériaux pour plus de détails sur les solutions, les réactifs, les matériaux et les instruments utilisés dans le protocole. Voir la figure 1 pour une vue d’ensemble de l’expérience.

1. Élevage de souris

1. Élever et maintenir les souris dans l’animalerie dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes, selon un horaire de 12 heures le jour et de 12 heures la nuit, avec un accès à volonté à la nourriture et à l’eau potable.
   REMARQUE : L’implantation des organoïdes est effectuée à l’âge de 6 à 8 semaines.

2. Échantillons de patients et échantillons cliniques

1. Placez les plaques de 12, 24 et 6 puits dans l’incubateur à 37 °C avant de commencer. Si possible, faites-le 1 jour à l’avance.
   1. Prélever le tissu dans l’heure qui suit la résection dans le milieu RPMI 1640 et le transporter au laboratoire pour commencer immédiatement le processus de dissociation. Placez le tissu dans une boîte de Pétri de 10 cm (plat préchauffé) et ajoutez une quantité suffisante de solution saline stérile pour éviter que le tissu ne se dessèche.
2. Dissociation des tissus cancéreux du foie pour la génération d’organoïdes
   1. Coupez le tissu en petits fragments de 1 à 2^mm2 à l’aide de scalpels. Utilisez des pinces à tissus supplémentaires pour stabiliser le tissu au cas où la coupe serait difficile.
   2. Placez les morceaux de tissu dans un tube de 15 mL avec 5 mL de tampon de dissociation (pH physiologique). Placer à 37 °C (armoire chauffante/incubateur) dans un appareil rotatif.
   3. Mélanger par pipetage toutes les 10 minutes et laisser agir environ 1 à 1,5 h, en répétant le processus de mélange toutes les 10 minutes.
      REMARQUE : Le mélange peut nécessiter de couper l’extrémité de la pipette pour augmenter le diamètre de l’orifice, empêchant ainsi les tissus surdimensionnés de se coincer dans la pointe de la pipette.
   4. Prélever 10 μL de mélange de tampon de dissociation cellulaire de l’étape 2.2.3 dans un tube en plastique de 0,5 mL, ajouter 10 μL de bleu de trypan et utiliser le compteur de cellules automatisé pour évaluer la viabilité des cellules et les grappes de cellules. Si des grappes sont visibles, répétez le processus de mélange (étape 3.3.) ; Sinon, passez à l’étape suivante.
   5. Prenez un tube de 50 ml, placez une passoire à cellules de 100 μm sur le dessus et passez le mélange à travers. À l’aide du piston d’une seringue de 5 ml, écrasez tous les fragments de tissu restants à travers le filtre. Lavez le tout avec 5 mL d’Ad-DF+++ et assurez-vous de recueillir la goutte du bas du filtre.
   6. Transférez le filtrat dans un tube conique de 15 ml. Centrifuger pendant 15 min à 300 × g.
   7. Aspirez le surnageant avec précaution en prenant soin de ne pas toucher la pastille. Ajouter 5 ml de tampon de lyse des globules rouges. Incuber pendant 5 à 10 minutes à température ambiante.
   8. Centrifuger pendant 5 min à 300 × g. Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans 1 mL de milieu avancé.
3. Comptage des cellules et évaluation de la viabilité cellulaire
   1. Ajouter 10 μL de bleu de trypan dans un tube de 1,5 mL et mélanger avec 10 μL de suspension cellulaire. Placez 10 μL du mélange sur les lames de comptage et comptez les cellules.
   2. Séparez le nombre de cellules nécessaires à la génération d’organoïdes et centrifugez pendant 5 min à 300 × g. En général, ensemencez 80 000 cellules par dôme et 20 μL de matrice de membrane basale par dôme (10 gouttes par puits par plaque à 6 puits).
   3. Si des cellules en excès restent en suspension, suspendez la pastille dans un milieu de congélation en suspension cellulaire (10 % de DMSO dans FBS), transférez-la dans un cryotube et placez-la dans un récipient de congélation. Transférez immédiatement le tube dans un congélateur à -80 °C pendant la nuit. Le lendemain, transférez dans de l’azote liquide jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
4. Placage pour la génération d’organoïdes
   1. Retirez le surnageant. Placez le tube sur de la glace et remettez la pastille en suspension avec une matrice de membrane basale.
   2. Sortez la plaque préchauffée de l’incubateur (préchauffée pendant la nuit). Faire de petites gouttes dans la plaque (20 μL de matrice de membrane basale par dôme [10 gouttes par puits]). Retournez la plaque et laissez la plaque pendant 5 min dans l’armoire d’écoulement.
   3. Après 5 min, transférez la plaque dans l’incubateur à 37 °C et laissez la plaque pendant ~20 min, permettant à la matrice de se solidifier. Ajouter 2 mL de milieu de culture organoïde ^6,7.
5. Entretien de la culture d’organoïdes
   1. Remplacez le milieu tous les 2 jours. Une fois que les organoïdes sont confluents dans le dôme de la matrice de la membrane basale et prêts à se dilater, calculez le rapport de séparation, par exemple 2x ou 3x en conséquence.
      REMARQUE : Enregistrez ces informations ; Il sera nécessaire dans les prochaines étapes.
   2. Retirez le milieu du coin du puits à l’aide d’une pointe P1000 en prenant soin de ne pas toucher les dômes de matrice.
   3. Ajoutez 100 μL de trypsine-EDTA à 0,25 % par dôme, grattez-le, recueillez-le dans un tube de 15 ml et ajoutez à nouveau une petite quantité de trypsine dans le puits pour recueillir le tout. Pipetez-le ~10x.
   4. Incuber 3 min dans le bain-marie à 37 °C et pipeter 10x pour dissocier les cellules avec une pointe P1000. Répétez cette étape toutes les 3 minutes pendant un maximum de 10 minutes.
   5. Ajoutez au moins le même volume de milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)/10 % de sérum de veau fœtal (FBS)/1 % de milieu de pénicilline-streptomycine (Pen-Strep) et mélangez de haut en bas lentement 2 fois. Faites le plein de DPBS.
   6. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min et retirer délicatement le surnageant. Remettre en suspension selon le rapport de fendillement décidé en fonction de la confluence des organoïdes, par exemple, 2x ou 3x la quantité initiale de matrice de membrane basale.
   7. Sortez la plaque préchauffée de l’incubateur (préchauffée pendant la nuit). Faire de petites gouttes dans la plaque (20 μL de matrice de membrane basale par dôme [10 gouttes par puits]). Retournez la plaque et laissez la plaque pendant 5 min dans l’armoire d’écoulement.
   8. Après 5 min, transférez la plaque dans l’incubateur à 37 °C. Laissez la plaque pendant ~20 min, permettant à la matrice de se solidifier. Ajouter 2 mL de milieu de culture organoïde.
6. Préparation d’organoïdes pour la fabrication d’un bloc de paraffine fixé au formol (FFPE)
   1. Retirez le milieu du coin du puits à l’aide d’une pointe P1000 en prenant soin de ne pas toucher les dômes de matrice. Ajoutez 200 μL de Dispase (2 mg/mL) et perturbez les gouttes avec une pointe de pipette P1000. Laisser dans l’incubateur pendant 80 min.
   2. Ajoutez 2 ml de solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco dans le puits, transférez-la dans un tube conique de 15 ml et remplissez-le de DPBS. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min, aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de paraformaldéhyde à 4 %. Réfrigérer au moins 1 h.
   3. Centrifugez à 300 × g pendant 5 min, aspirez le paraformaldéhyde et remettez en suspension la pastille avec le gel de traitement de l’échantillon pour créer une goutte. Attendez 40 min pour que les gouttes se solidifient. Placez la goutte de gel contenant les cellules dans une cassette d’histologie. Déplacez la cassette pour la déshydrater et enfoncez-la ensuite dans de la paraffine pour la coupe et la coloration H/E ^8,9.
7. Préparation d’organoïdes pour injection
   1. Sortez la plaque contenant l’organoïde en croissance de l’incubateur et placez-la dans l’armoire à flux.
   2. Suivez les étapes 2.5.2 à 2.5.4.
   3. Ajouter 2 ml de DMEM et mélanger.
   4. Ajouter 10 μL de bleu de trypan dans un tube de 1,5 mL et mélanger avec 10 μL de suspension cellulaire.
   5. Placez 10 μL du mélange sur les lames de comptage et comptez les cellules. Calculez le nombre moyen de cellules des deux chambres. Si la différence est trop importante entre les deux chambres, envisagez de refaire le compte.
   6. Calculez le volume de suspension cellulaire requis pour 10^{à 6} cellules et distribuez ce volume dans des tubes de 1,5 ml. Centrifugez à 300 × g pendant 5 min et placez les tubes sur de la glace.
   7. Retirez délicatement le surnageant et ajoutez 5 μL de DMEM et 5 μL de matrice de membrane basale. Mélangez soigneusement la suspension par pipetage tout en gardant la suspension froide pendant le processus.
   8. Placez les tubes de 1,5 mL contenant les organoïdes sur de la glace pendant le transport vers les souris et procédez à l’injection.

3. Injection d’organoïde chez la souris

1. Etapes périopératoires
   1. Retirez l’animal de la cage principale et placez-le dans une cage fraîche isolée avec de l’eau.
   2. Anesthésier la souris avec 1,5 % à 2,5 % d’isoflurane.
   3. Effectuez une injection sous-cutanée dans le cou avec 10 μL de buprénorphine (0,3 mg/mL) 30 min avant le début de la chirurgie.
   4. Immédiatement avant le début de la chirurgie, peignez soigneusement les yeux des animaux avec du Carbomerum (par exemple, Lacrinorm) pour éviter toute sécheresse des yeux pendant la chirurgie. Ne touchez pas la cornée pendant l’application pour éviter toute érosion de la cornée.
   5. Placez les animaux sur une surface propre et stérile et manipulez-les avec des gants en plastique frais, un filet à cheveux et une blouse de laboratoire spéciale utilisée uniquement dans l’installation des souris.
   6. Utilisez deux phares émettant de la chaleur près de l’animal pour offrir une vue suffisante. En cas de doute ou d’inquiétude au sujet de l’hypothermie pendant la chirurgie, utilisez une autre lampe chauffante ou un tapis chauffant.
2. Laparotomie
   REMARQUE : Avant le début de l’intervention chirurgicale, la profondeur de l’anesthésie a été vérifiée par le test de pincement des orteils. Au cours de la procédure, une anesthésie adéquate a été fournie par des contrôles de routine et une surveillance de la fréquence respiratoire et ajustée s’il y avait une augmentation pertinente. Le matériel chirurgical a été nettoyé et désinfecté selon les directives internes de notre animalerie.
   1. Placez la souris anesthésiée en position couchée, étendez les quatre extrémités et fixez-les avec du ruban adhésif. Retirez la fourrure en appliquant une crème dépilatoire et utilisez un mouchoir humide pour enlever l’excès de crème et de fourrure.
      REMARQUE : L’épilation fonctionne mieux si un coton-tige est utilisé pour masser la crème dans la fourrure contre le grain.
   2. Localiser la linea alba, qui est la cible de la laparotomie. Identifiez également les artères épigastriques supérieures et inférieures. Veillez à ne pas endommager les récipients pour éviter les blessures.
   3. Faites une incision le long de la linea alba avec des pinces et des ciseaux microchirurgicaux du bas-ventre au cartilage xiphoïde.
   4. Insérez les écarteurs et ajustez la direction de la traction pour une exposition optimale de la partie supérieure de l’abdomen (Figure 2A,B).
      REMARQUE : Nous utilisons des trombones pliés comme écarteurs avec des élastiques attachés pour la fixation.
3. Injection d’organoïdes
   1. Placez une serviette propre juste à côté de l’incision et déposez quelques gouttes de solution saline dessus. Extériorisez l’intestin grêle et le caecum et placez-les sur la serviette humide.
   2. Exposez le lobe supérieur droit (LRS) jusqu’à ce qu’une injection soit possible.
   3. Préparez la seringue Hamilton, rincez-la à l’eau et placez un repère à 2-3 mm de l’extrémité comme référence pour l’injection.
   4. Tirez la seringue avec le mélange d’organoïdes préparé et injectez l’aiguille jusqu’à la marque. Injectez lentement les organoïdes en position stable ; Ne bougez pas l’aiguille pendant ce temps.
   5. Attendre 15-20 s pour éviter le reflux du mélange. Retirez l’aiguille et exercez une certaine pression avec un coton-tige sur le site d’injection. Vérifiez l’abdomen à la recherche d’une rupture du lobe du foie et d’un reflux. Rincez l’abdomen avec 0,5 mL de solution saline stérile et fermez l’abdomen avec une suture coulante à l’aide d’une suture résorbable.
      REMARQUE : Le site chirurgical a été recouvert d’un champ stérile. Les instruments chirurgicaux utilisés pendant la procédure ont été principalement nettoyés avec de l’eau et des agents de nettoyage pour éliminer les restes macroscopiques. Les instruments ont ensuite été traités dans une solution de stérilisation. Les consommables tels que les fils, les gants ou les cotons-tiges n’étaient utilisés qu’une seule fois pour des raisons d’hygiène et étaient stériles.

4. Résection mineure (30 % du tissu hépatique)

1. Effectuez la laparotomie comme indiqué ci-dessus à l’étape 3.2.
2. Utilisez des cotons-tiges humides et poussez le ML vers le crâne pour créer plus d’espace dans le champ chirurgical de la LLL.
3. Retournez la LLL par le biais du crâne et exposez le lobe caudé (CL) et le ligament, qui sont habituellement présents entre la CL et la LLL (Figure 2C).
4. Coupez complètement le ligament et insérez la ligature (fil fin non résorbable, par exemple Prolene 5-0) sous le LLL. Pour vous assurer qu’il reste dans cette position, humidifiez la ligature et déplacez-la vers le quadrant supérieur droit.
5. Retournez le LLL dans le sens caudal. Guidez l’extrémité libre gauche de la ligature autour de l’extrémité gauche de la LLL. Guidez l’extrémité libre droite de la ligature autour de l’extrémité droite de la LLL. Appliquez une traction caudale sur la LLL à l’aide d’un coton-tige et assurez-vous du positionnement correct et central de la ligature.
6. Faites un double demi-nœud. Fixez le nœud avec un deuxième demi-nœud fait dans l’autre sens sans le serrer complètement. Serrez un peu les nœuds, vérifiez le bon placement de la ligature et repositionnez-la pour garantir un bon positionnement.
7. Serrez complètement le nœud en maintenant l’extrémité libre du crâne en position à l’aide d’une pince à bout émoussé et tirez l’extrémité libre caudale à l’aide d’une autre paire de pinces (figure 2D). Fixez le nœud avec un deuxième demi-nœud fait dans la direction opposée.
8. Réséquez le lobe du foie. Coupez près de la ligature sans la couper.

5. Résection majeure (65 % du tissu hépatique)

1. Effectuez la résection mineure de la LLL comme indiqué ci-dessus (étapes 3.4.1-3.4.8).
2. Transectez le ligament falciforme pour mobiliser le ML. Retournez le lobe crânien. Insérez la ligature sous le lobe et retournez le lobe vers la queue.
3. Enroulez les extrémités libres autour du lobule. Répétez le placement de la ligature en cas d’erreur de placement lors de la manipulation. Une fois que la ligature est correctement positionnée, placez un double demi-nœud, faites-le lentement et repositionnez la ligature si nécessaire.
4. Faites un deuxième demi-nœud dans la direction opposée et serrez-le complètement. Ajoutez un troisième demi-nœud dans le sens opposé.
5. Réséquez le lobe.
6. Rincer l’abdomen avec une solution saline stérile et placer les intestins à leur place anatomique.

6. Fermeture de l’abdomen

1. Saisissez la peau et le péritoine à l’aide d’une pince et faites un point de suture avec une suture résorbable (par exemple, Monocryl 5-0) à l’extrémité supérieure de la ligne d’incision. Assurez-vous de sortir par le côté péritonéal.
2. Effectuez le deuxième point sur la contrepartie de l’incision, en sortant du côté de la peau. Faites le nœud fermement tout en laissant l’extrémité libre sans l’aiguille courte et l’extrémité avec l’aiguille longue. Coupez l’extrémité courte à une longueur de 2 mm.
3. Continuez la suture courante et terminez par un nœud à l’extrémité inférieure de l’incision.
4. Nettoyez l’abdomen de la souris de tout sang restant.

7. Soins postopératoires

1. Après la fermeture de l’abdomen, injecter 10 μL supplémentaires de buprénorphine (0,3 mg/mL) par voie sous-cutanée dans le cou. Placez les animaux dans la cage isolée précédemment utilisée, partiellement posée sur un tapis chauffant. Fournissez de la nourriture facilement accessible sur le sol de la cage.
   REMARQUE : Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris conscience.
2. Effectuer les contrôles postopératoires à 2 h et 6 h après l’intervention. Observez de près le comportement en accordant une attention particulière à tout signe de douleur ; administrer 10 μL de bupivacaïne supplémentaire si nécessaire.
3. Une fois que la souris est complètement rétablie, mais pas avant 6 h après l’opération et au plus tard 24 h après l’opération, réintroduisez-la dans la cage principale. Surveillez de près le comportement de tous les animaux impliqués face à toute agression ou autre comportement suspect. En cas de doute sur une faiblesse postopératoire de l’animal, laissez-le isolé pendant la nuit pour récupérer jusqu’à la réintroduction finale.
4. Après le dernier contrôle postopératoire 1 jour après l’intervention, procéder à la pesée régulière des animaux.
   REMARQUE : L’analgésie a été administrée 4 et 8 heures après l’opération. Une surveillance supplémentaire a été effectuée à 12, 24 et 48 heures après l’opération, et les souris ont été vérifiées pour tout type de douleur ou de détresse. Si des signes de douleur étaient observés, une autre dose de buprénorphine était administrée.

8. Surveillance de la croissance tumorale

1. Immobiliser les souris à l’aide d’une anesthésie à l’isoflurane et utiliser l’échographie pour visualiser l’implantation tumorale à partir de 2 semaines après l’injection¹⁰.
2. Euthanasier les souris avec du CO₂.

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Résultats

Nous avons examiné la contribution des lobes hépatiques uniques au volume total du foie et avons constaté que la LLL représente 33 % du volume total du foie. La CM représente 32 % du volume hépatique total, la LRS 13 %, la RIL 10 % et la CL 10 % (tableau 2). Les boîtes à moustaches montrent que la contribution relative des lobes hépatiques est comparable entre les différentes souris d’une même souche (Figure 3B). Par conséquent...

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Discussion

Étapes critiques du protocole
Anesthésie chez la souris
Le but de l’anesthésie est de convertir la souris en toute sécurité dans un état dans lequel elle tolérera les manipulations chirurgicales. Dans le même temps, l’effet de l’anesthésie ne doit pas être trop fort, afin d’éviter l’arrêt cardiorespiratoire et la mort qui s’ensuit. L’anesthésie par inhalation est plus facile à doser, ce qui permet au chercheur d’ajust...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/F12 (adDMEM/F12)	Life Technologies	12634-034
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3733-50G
Bupaq Buprenorphinum 0.3 mg pro 1 mL	Streuli Tiergesundheit AG	1121915AB
Centrifuge 5810R	Eppendorf
Collagenase IV	Worthington	LS004189
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix (10 mL)	Corning (Merk)	CLS356231-1EA
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher
Deoxyribonuclease I Type IV from Bovine (DNAse)	Sigma-Aldrich	D5025-150KU
DMEM (1x)	Gibco	41965-039
DPBS, no calcium, no magnesium (500 mL)	Gibco	14190-094
Fetal Bovine Serum (FBS) (South America). Heat Inactivated – (500 mL)	Lubio Science	S181H-500
Glutamax (100x)	Gibco	9149793
Grant SUB Aqua Pro Water Bath	Grant Instruments
HEPES (1 M)	Thermo Fisher	15630056
Histogel	Thermo Fisher	R904012	specimen-processing  gel
Hyaluronidase Type IV from sheep (Tested)	Sigma-Aldrich	H6254-500MG
Inverted Microscope Olympus CKX53	Olympus
MacsMix Tube Rotator	Miltenyi Biotec
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
Red Blood Cell Lysis	Roche	11814389001
RPMI 1640 Medium	Gibco	72400-021
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (100 mL)	Gibco	25200-056
Vitaris CO2 Incubator	Vitaris AG
Y-27632 dihydrochloride (Rock Inhibitor)	Abmole Bioscience	M1817