AQRNA-seq pour la quantification de petits ARN

Résumé

Le séquençage de l’ARN par quantification absolue (AQRNA-seq) est une technologie développée pour quantifier le paysage de tous les petits ARN dans les mélanges biologiques. Ici, les étapes de préparation de la bibliothèque et de traitement des données d’AQRNA-seq sont démontrées, quantifiant les changements dans le pool d’ARN de transfert (ARNt) chez Mycobacterium bovis BCG pendant la dormance induite par la famine.

Résumé

AQRNA-seq fournit une relation linéaire directe entre le nombre de lectures de séquençage et le petit nombre de copies d’ARN dans un échantillon biologique, permettant ainsi une quantification précise du pool de petits ARN. La procédure de préparation de la banque AQRNA-seq décrite ici implique l’utilisation de liaisons de séquençage conçues sur mesure et une étape pour réduire les modifications de l’ARN de méthylation qui bloquent la processivité de la transcription inverse, ce qui entraîne une augmentation du rendement d’ADNc de pleine longueur. En outre, une mise en œuvre détaillée du pipeline bioinformatique qui l’accompagne est présentée. Cette démonstration de l’AQRNA-seq a été réalisée au moyen d’une analyse quantitative des 45 ARNt de Mycobacterium bovis BCG récoltés pendant 5 jours choisis au cours d’une période de 20 jours de privation de nutriments et de 6 jours de réanimation. Les efforts en cours pour améliorer l’efficacité et la rigueur d’AQRNA-seq seront également abordés ici. Il s’agit notamment d’explorer des méthodes permettant d’éviter la purification sur gel afin d’atténuer les problèmes de dimères d’amorce après l’amplification par PCR et d’augmenter la proportion de lectures sur toute la longueur afin de permettre une cartographie de lecture plus précise. Les améliorations futures d’AQRNA-seq seront axées sur la facilitation de l’automatisation et de la mise en œuvre à haut débit de cette technologie pour quantifier toutes les petites espèces d’ARN dans des échantillons de cellules et de tissus provenant de divers organismes.

Introduction

Le séquençage de nouvelle génération (NGS), également connu sous le nom de séquençage massivement parallèle, est une technologie de séquençage de l’ADN qui implique la fragmentation de l’ADN, la ligature d’oligonucléotides adaptateurs, l’amplification basée sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR), le séquençage de l’ADN et le réassemblage des séquences de fragments dans un génome. L’adaptation du NGS à l’ARN séquencé (RNA-seq) est une approche puissante pour identifier et quantifier les transcrits d’ARN et leurs variants¹. Des développements innovants dans les flux de travail de préparation de banques d’ARN et les pipelines d’analyse bioinformatique, associés aux progrès de l’instrumentation de laboratoire, ont élargi le répertoire des applications de séquençage de l’ARN, progressant au-delà du séquençage de l’exome vers des omiques fonctionnelles avancées telles que le profilage d’ARN non codant², l’analyse de cellule unique³, la transcriptomique spatiale ^4,5, l’analyse d’épissage alternatif⁶, entre autres. Ces méthodes avancées de séquençage de l’ARN révèlent des fonctions complexes de l’ARN grâce à l’analyse quantitative du transcriptome dans les cellules et les tissus normaux et malades.

Malgré ces avancées en matière de RNA-seq, plusieurs caractéristiques techniques clés limitent la puissance quantitative de la méthode. Bien que la plupart des méthodes de séquençage de l’ARN permettent une quantification précise et exacte des changements dans les niveaux d’ARN entre des variables expérimentales (c’est-à-dire des échantillons biologiques et/ou des états physiologiques), elles ne peuvent pas fournir de comparaisons quantitatives des niveaux de molécules d’ARN dans un échantillon. Par exemple, la plupart des méthodes de séquençage de l’ARN ne peuvent pas quantifier avec précision le nombre relatif de copies de molécules isoaccepteurs d’ARNt individuelles dans un pool cellulaire d’ARNt exprimés. Comme souligné dans la publication^{complémentaire 7}, cette limitation du séquençage de l’ARN découle de plusieurs caractéristiques de la structure de l’ARN et de la biochimie de la préparation des banques. Par exemple, l’activité des enzymes de ligature utilisées pour fixer les liaisons de séquençage aux extrémités 3' et 5' aux molécules d’ARN est fortement influencée par l’identité des nucléotides terminaux de l’ARN et des liaisons de séquençage. Cela conduit à de grandes variations dans l’efficacité des ligatures de liaison et à de profondes augmentations artificielles des lectures de séquençage ^8,9,10.

Une deuxième série de limitations découle des propriétés structurelles inhérentes aux molécules d’ARN. Plus précisément, la formation de la structure secondaire de l’ARN et les changements dynamiques dans les dizaines de modifications post-transcriptionnelles de l’ARN de l’épitranscriptome peuvent provoquer une chute ou une mutation de la polymérase au cours de la transcription inverse. Ces erreurs entraînent une synthèse incomplète ou tronquée de l’ADNc ou une séquence d’ARN altérée. Bien que ces deux phénomènes puissent être exploités pour cartographier des structures secondaires ou certaines modifications, ils dégradent la précision quantitative du séquençage de l’ARN si les étapes ultérieures de préparation de la bibliothèque ne parviennent pas à capturer des ADNc tronqués ou si le traitement des données rejette des séquences mutées ne correspondant pas à un ensemble de données de référence^11,12. De plus, l’immense diversité chimique, de longueur et structurelle des transcrits d’ARN, ainsi que le manque d’outils pour fragmenter uniformément les ARN longs, diminuent l’applicabilité de la plupart des méthodes de séquençage de l’ARN à toutes les espèces d’ARN¹³.

La méthode AQRNA-seq (absolute quantification RNA sequencing) a été développée pour lever plusieurs de ces contraintes techniques et biologiques qui limitent la précision quantitative⁷. En minimisant les biais dépendants de la séquence dans la capture, la ligature et l’amplification lors de la préparation de la bibliothèque de séquençage de l’ARN, AQRNA-seq atteint une linéarité supérieure par rapport aux autres méthodes, quantifiant avec précision 75 % d’une bibliothèque de référence de 963 miARN avec une précision 2 fois supérieure. Cette corrélation linéaire du nombre de lectures de séquençage et de l’abondance de l’ARN est également observée dans l’analyse d’un pool de longueurs variables d’étalons d’oligonucléotides d’ARN et en référence à des méthodes orthogonales comme le transfert de Northern. L’établissement de la linéarité entre le nombre de lectures de séquençage et l’abondance de l’ARN permet à l’AQRNA-seq d’obtenir une quantification précise et absolue de toutes les espèces d’ARN au sein d’un échantillon.

Voici une description du protocole pour le flux de travail de préparation de la bibliothèque AQRNA-seq et du pipeline d’analyse de données en aval qui l’accompagne. La méthode a été appliquée pour élucider la dynamique de l’abondance de l’ARNt pendant la dormance induite par la famine et la réanimation ultérieure dans le modèle de tuberculose du modèle de la tuberculose à Bacilles de Calmette et Guérin de Mycobacterium bovis . Les résultats ont été présentés pour la visualisation exploratoire des données de séquençage, ainsi que pour les analyses ultérieures de regroupement et d’expression différentielle qui ont révélé des modèles discernables dans l’abondance de l’ARNt associés à divers phénotypes.

Protocole

REMARQUE : La figure 1 fournit une illustration graphique des procédures impliquées dans la préparation de la bibliothèque AQRNA-seq. Des informations détaillées concernant les réactifs, les produits chimiques et les colonnes/kits utilisés dans la procédure se trouvent dans la table des matériaux. Il est recommandé d’effectuer une évaluation complète de la pureté, de l’intégrité et de la quantité des échantillons d’ARN d’entrée à l’aide (i) d’une électrophorèse sur gel d’agarose à 3 %, (ii) d’outils d’électrophorèse automatisés pour le contrôle de la qualité des échantillons de biomolécules (voir le tableau des matériaux), et (iii) d’une spectrophotométrie UV-visible et/ou d’une quantification fluorométrique. Il est obligatoire de conserver toutes les réactions et les mastermixes sur de la glace, sauf indication contraire. Transporter les réactifs (p. ex. enzymes) dans des glacières à destination et en provenance d’un entrepôt à -20 °C afin de préserver leur durée de conservation et d’éviter les multiples cycles de congélation-décongélation des intermédiaires de la bibliothèque.

1. Déphosphorylation des ARN

REMARQUE : L’élimination du phosphate 5' (P ; donneur) empêche l’auto-ligature au 3'-hydroxyle (OH ; accepteur) des ARN. Les linkers ne s’auto-ligaturent pas car leur extrémité 3' est modifiée pour incorporer soit une didésoxycytidine (Linker 1), soit un espaceur (Linker 2). Les linkers ne peuvent être ligaturés qu’en joignant leur 5'-P au 3'-OH des ARN ou des ADNc.

1. Préparez la réaction de déphosphorylation dans un tube PCR stérile (p. ex., tube de 200 μL ou de 500 μL) en ajoutant jusqu’à 2 μL de l’échantillon d’ARN, 0,5 μL d’inhibiteur de RNase 40 U/μL, 1 μL d’étalon interne de 0,5 μM (tableau 1), 0,5 μL de tampon de réaction 10x ARN ligase T4, 1 μL de 1 U/μL de phosphatase alcaline de crevette, et suffisamment d’eau exempte de RNase pour porter le volume total à 5 μL.
   REMARQUE : Pour des échantillons typiques, 75 ng d’ARN (ou environ 2 pmol pour un ARN de 80 nt) sont considérés comme suffisants pour la quantification des petits ARN à l’aide de ce protocole.
2. Incuber à 37 °C pendant 30 min pour déphosphoryler les ARN, puis à 65 °C pendant 5 min pour inactiver l’enzyme et dénaturer les ARN. Conserver les échantillons à 4 °C pendant au moins 10 minutes pour éviter la renaturation.

2. Ligature de l’agent de liaison 1 à l’extrémité 3' des ARN

1. Préparez la réaction de ligature Linker 1 dans un tube PCR stérile en ajoutant 5 μL d’ARN déphosphorylés (produits de l’étape 1), 0,5 μL d’inhibiteur de RNase 40 U/μL, 1 μL de Linker 1 100 μM (tableau 1), 3 μL d’ATP 10 mM, 2,5 μL de tampon de réaction ARN ligase T4, 15 μL de PEG8000 (solution à 50%), 2 μL d’ARN ligase 1 T4 30 U/μL et 1 μL d’eau exempte de RNase.
   REMARQUE : Les réactifs peuvent être transformés en mélange maître pour faciliter le traitement des échantillons. N’incluez pas l’ARN ligase PEG8000 et T4 dans le mélange maître.
2. Incuber à 25 °C pendant 2 h puis à 16 °C pendant 16 h pour ligaturer Linker 1 aux ARN.
3. Purifier en colonne les ARN ligaturés par Linker-1. Utilisez une trousse pour la récupération et le nettoyage de l’ADN et de l’ARN (voir la Table des matériaux).
   REMARQUE : Ce protocole de purification de colonne s’applique à toutes les purifications de colonne ultérieures à l’aide du même kit. Les kits qui utilisent la technologie de filtration sur gel pour éliminer les terminaisons de colorant des réactions de séquençage (voir le tableau des matériaux) ne peuvent pas être utilisés ici, car PEG8000 est incompatible avec les filtres en gel de ces kits. Il est recommandé de conserver une aliquote (1,2 μL) de chaque échantillon après purification. Si nécessaire, ces aliquotes peuvent être utilisées pour vérifier l’efficacité de la ligature en exécutant un analyseur d’acides nucléiques commercial. Conservez les échantillons purifiés restants sur de la glace ou à -20 °C jusqu’à ce que les étapes suivantes se multiplient.
   1. Pour un volume d’échantillon < 50 μL, ajoutez de l’eau sans RNase pour l’amener à 50 μL. Ajoutez 2 volumes du tampon de liaison oligo (fourni dans le kit) à 1 volume de l’échantillon. Ajoutez 8 volumes d’éthanol à 100 % à 1 volume de l’échantillon.
   2. Chargez l’échantillon (jusqu’à 750 μL à la fois) dans une colonne placée à l’intérieur d’un tube de prélèvement de 2 mL (fourni dans la trousse). Pour lier les ARN à la colonne, centrifuger à 10 000 x g pendant 30 s et jeter le liquide dans le tube de collecte. Remettez la colonne dans le tube de collecte.
   3. Pour éliminer les impuretés de la colonne, ajoutez 750 μL du tampon de lavage de l’ADN (fourni dans le kit) dans la colonne. Centrifuger à 10 000 x g pendant 30 s et jeter le flux. Remettez la colonne dans le tube de collecte.
   4. Centrifuger à vitesse maximale (par exemple, 16 000 x g pour une microcentrifugeuse de paillasse) pendant 1 minute supplémentaire pour éliminer le tampon de lavage d’ADN résiduel.
   5. Pour éluer les ARN, déplacez délicatement la colonne dans un tube stérile de 1,5 ml, ajoutez de l’eau sans RNase dans la colonne. Utilisez un volume plus important que nécessaire lors de l’élution des ARN pour tenir compte de la perte de volume potentielle pendant le processus d’élution. Par exemple, si 15 μL sont nécessaires pour l’étape suivante, ajoutez 17 μL d’eau sans RNase pour l’élution. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 30 s.

3. Élimination des méthylations post-transcriptionnelles par l’AlkB déméthylase

REMARQUE : AlkB est une enzyme bactérienne qui élimine les groupes méthyles de certains nucléotides méthylés dans l’ADN et l’ARN, mais pas tous. L’élimination de plusieurs types de ribonucléotides méthylés dans l’ARN empêche la chute de la transcriptase inverse pour permettre des lectures plus complètes et l’identification des sites de modification. Cette étape doit être contrôlée à un faible pH pour éviter une dégradation inattendue des ARN.

1. Préparez une solution mère de 1 M de 2-cétoglutarate en dissolvant 1,4611 g de 2-cétoglutarate (146,11 g par M) dans 10 ml d’eau exempte de RNase. Filtre : stérilisez la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm. Aliquote la solution mère dans des tubes stériles de 2 mL et conserver à -20 °C.
2. Préparez une solution mère d’acide L-ascorbique 0,5 M en dissolvant 0,88 g d’acide L-ascorbique (176,12 g par M) dans 10 ml d’eau exempte de RNase. Filtre : stérilisez la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm. Aliquote la solution mère dans des tubes stériles de 2 mL et conserver à -20 °C.
3. Préparez une solution mère de sulfate ferreux d’ammonium hexahydraté 0,25 M en dissolvant 0,9835 g de sulfate ferreux hexahydraté d’ammonium (392,14 g par M) dans 10 ml d’eau exempte de RNase. Filtre : stérilisez la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm. Aliquote la solution mère dans des tubes stériles de 2 mL et conserver à -20 °C.
4. Préparez une solution mère de 1 M HEPES en dissolvant 2,383 g de HEPES (238,30 g par M) dans 10 mL d’eau exempte de RNase. Ajustez le pH de la solution à 8 à l’aide de NaOH et filtrez la stérilisation de la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm. Aliquote la solution mère dans des tubes stériles de 2 mL et conserver à -20 °C.
5. Préparez un tampon de réaction 2x AlkB. Pour obtenir 10 ml de tampon, mélanger 1,5 μL de 1 M 2-cétoglutarate (réalisé à l’étape 3.1), 80 μL d’acide L-ascorbique 0,5 M (fabriqué à l’étape 3.2), 6 μL de sulfate ferreux d’ammonium 0,25 hexahydraté (fabriqué à l’étape 3.3), 100 μL de 10 mg/mL de BSA, 1000 μL de 1 M HEPES (effectué à l’étape 3.4 ; ajouter en dernier), et 8812,5 μL d’eau exempte de RNase. Filtre : stérilisez le tampon à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm.
   REMARQUE : Le tampon de réaction 2x AlkB doit être préparé frais immédiatement avant chaque expérience en raison de la labilité chimique des composants.
6. Préparez la réaction de digestion d’AlkB dans un tube PCR stérile en ajoutant 20 μL d’ARN ligaturés Linker-1 (produits de l’étape 2), 50 μL du tampon de réaction 2x AlkB (réalisé à l’étape 3.5), 2 μL d’AlkB déméthylase, 1 μL d’inhibiteur de RNase et 27 μL d’eau exempte de RNase.
7. Incuber à température ambiante pendant 2 h pour éliminer les méthylations post-transcriptionnelles des ARN.
8. Pour supprimer AlkB de la réaction, suivez les étapes décrites ci-dessous.
   1. Pour une séparation de phase propre, ajoutez 50 μL d’eau exempte de RNase dans la réaction AlkB, puis ajoutez 100 μL de phénol : chloroforme : alcool isoamylique 25:24:1 (pH = 5,2).
   2. Agiter à la main pendant 10 s, puis centrifuger à 16 000 x g pendant 10 min. Assurez-vous que le rotor de la centrifugeuse de paillasse est compatible avec les tubes PCR. Utilisez des adaptateurs si nécessaire.
   3. Transférez les ARN (c.-à-d. la couche aqueuse sur le dessus, soit environ 140 μL) dans un tube stérile de 1,5 ml. Si le chloroforme (c’est-à-dire la couche inférieure) est mélangé à la couche aqueuse, centrifuger à nouveau avec les mêmes réglages.
   4. Ajouter 100 μL de chloroforme aux ARN extraits pour éliminer le phénol résiduel. Agiter à la main pendant 10 s, puis centrifuger à 16 000 x g pendant 10 min.
   5. Transférez les ARN (c.-à-d. la couche aqueuse sur le dessus, soit environ 120 μL) dans un tube stérile de 1,5 ml.
9. Purifier en colonne les ARN extraits. Utilisez une trousse pour la récupération et le nettoyage de l’ADN et de l’ARN (voir la Table des matériaux). Suivez le protocole détaillé à l’étape 2.3 pour effectuer la purification de la colonne.

4. Suppression de l’excès de Linker 1

REMARQUE : Il est recommandé de conserver une aliquote (1,2 μL) de chaque échantillon après la purification. Si nécessaire, ces aliquotes peuvent être utilisées pour vérifier l’efficacité de la digestion RecJf en exécutant un analyseur d’acides nucléiques commercial. Procéder immédiatement avec les échantillons purifiés à la transcription inverse.

1. Préparez la réaction d’inénylation dans un tube PCR stérile en ajoutant 15 μL d’ARN ligaturés Linker-1 (produits de l’étape 3), 1 μL d’inhibiteur de RNase 40 U/μL, 2 μL de tampon 10x kit 2 (voir le tableau des matériaux) et 2 μL de 50 U/μL de 5'-deadenylase.
2. Incuber à 30 °C pendant 1 h pour retirer l’adénine à l’extrémité 5' de Linker 1. Ajoutez 2 μL de 30 U/μL de RecJf dans la réaction d’inétylation.
3. Incuber à 37 °C pendant 30 min pour digérer l’excès de Linker 1. Ajoutez encore 2 μL de 30 U/μL de RecJf dans la réaction.
4. Incuber à 37 °C pendant 30 min pour poursuivre la digestion de l’excès de Linker 1 puis à 65 °C pendant 20 min pour dénaturer l’enzyme.
5. Purifier en colonne les ARN ligaturés par Linker-1. Utilisez un kit qui utilise la technologie de filtration sur gel pour éliminer les terminaisons de colorant des réactions de séquençage (voir le tableau des matériaux), car elle est efficace pour éliminer les restes courts (par exemple, les oligonucléotides d’une longueur de 2 à 10 pb). Suivez les étapes décrites ci-dessous pour la purification.
   1. Préparez les colonnes de filtre gel selon le protocole du fabricant. Placez une colonne dans un tube stérile de 1,5 mL et chargez la colonne avec 24 μL de l’échantillon.
   2. Pour purifier les ARN, centrifuger à 800 x g pendant 3 min et jeter la colonne. Les ARN purifiés se trouvent dans l’éluant.

5. Réaction de transcription inverse (RT)

REMARQUE : La configuration de réaction RT (voir Table des matériaux) suivante suit le protocole du fabricant, avec des modifications mineures pour permettre la compatibilité AQRNA-seq.

1. Préparez la réaction de recuit de l’amorce RT dans un tube PCR stérile en ajoutant 24 μL d’ARN matrice (produits de l’étape 4), 1 μL d’amorce RT 2 μM (tableau 1) et 1 μL de dNTP (10 mM de chaque type de nucléotides).
2. Incuber à 80 °C pendant 2 min pour recuire les amorces RT sur les ARN matrices, puis refroidir immédiatement sur de la glace pendant 2 min.
3. Préparez la réaction RT en ajoutant 6 μL de tampon de réaction 5x RT, 1 μL d’inhibiteur de RNase 40 U/μL et 1 μL de transcriptase inverse dans le tube de réaction de recuit.
4. Incuber à 50 °C pendant 2 h pour retranscrire inversement les matrices d’ARN, puis à 70 °C pendant 15 min pour inactiver l’enzyme. Les produits RT (c’est-à-dire les hybrides ARN-ADNc) peuvent être conservés à 4 °C ou -20 °C pendant la nuit.

6. Hydrolyse de l’ARN

1. Ajouter 1 μL de NaOH 5 M dans l’hybride ARN-ADNc (produits de l’étape 5). Incuber à 93 °C pendant 3 min pour hydrolyser le brin d’ARN de l’hybride ARN-ADNc.
2. Ajouter 0,77 μL de HCl 5 M pour neutraliser la réaction. Après avoir ajouté HCl, effleurez pour mélanger et tournez le tube. La neutralisation est instantanée.
   REMARQUE : Il est recommandé de tester la quantité précise de 5 M HCl nécessaire pour neutraliser 1 μL de NaOH (par exemple, à l’aide de bandelettes de pH) dans des conditions tamponnées.
3. Purifier en colonne les ADNc simple brin. Utilisez une trousse pour la récupération et le nettoyage de l’ADN et de l’ARN (voir la Table des matériaux). Suivez le protocole détaillé à l’étape 2.3 pour effectuer la purification de la colonne.
   REMARQUE : Les kits qui utilisent la technologie de filtration sur gel pour éliminer les terminaisons de colorant des réactions de séquençage (voir le tableau des matériaux) ne peuvent pas être utilisés ici en raison de la variation du pH lors des étapes précédentes.
4. Vaporisez rapidement les ADNc purifiés à < 5 μL, puis ajoutez de l’eau sans RNase pour ramener le volume à 5 μL. Veillez à ne pas accélérer la cuisson des ADNc jusqu’à ce qu’ils soient complètement secs.
5. Transférez les ADNc purifiés dans un tube PCR stérile. Les ADNc purifiés peuvent être conservés à -20 °C jusqu’à 1 semaine.

7. Ligature de Linker 2 à l’extrémité 3' des ADNc

1. Préparez la réaction de ligature Linker 2 dans un tube PCR stérile en ajoutant 5 μL d’ADNc (produits de l’étape 6), 1 μL de Linker 2 50 μM (tableau 1), 2 μL de tampon de réaction d’ADN ligase 10x T4, 1 μL d’ATP 10 mM, 9 μL de PEG8000 (solution à 50 %) et 2 μL d’ADN ligase T4 à 400 U/μL.
   REMARQUE : Les réactifs peuvent être transformés en mélange maître pour faciliter le traitement des échantillons. N’incluez pas de PEG8000 et d’ADN ligase T4 dans le mélange maître.
2. Incuber à 16 °C pendant 16 h pour ligaturer Linker 2 aux ADNc.
3. Purifier en colonne les ADNc ligaturés par Linker-2. Utilisez une trousse pour la récupération et le nettoyage de l’ADN et de l’ARN (voir la Table des matériaux). Suivez le protocole détaillé à l’étape 2.3 pour effectuer la purification de la colonne.

8. Suppression de l’excès de Linker 2

1. Préparez la réaction d’inénylation dans un tube PCR stérile en ajoutant 16 μL d’ADNc ligaturés par Linker-2, 2 μL de tampon 10x kit 2 et 2 μL de 50 U/μL de 5'-deadenylase. Incuber à 30 °C pendant 1 h pour retirer l’adénine à l’extrémité 5' de Linker 2.
2. Ajoutez 2 μL de 30 U/μL de RecJf dans la réaction d’inétylation. Incuber à 37 °C pendant 30 min pour digérer l’excès de Linker 2. Ajoutez encore 2 μL de 30 U/μL de RecJf dans la réaction.
3. Incuber à 37 °C pendant 30 min pour poursuivre la digestion de l’excès de Linker 2 puis à 65 °C pendant 20 min pour dénaturer l’enzyme.

9. Amplification PCR des ADNc avec des amorces de séquençage

1. Attribuez des amorces PCR aux échantillons. Chaque échantillon a besoin d’une combinaison unique d’amorces directes et inverses (Tableau 1) pour un multiplexage efficace.
2. Ajoutez de l’eau exempte de RNase pour porter le volume de l’échantillon à 25 μL. Conservez 5 μL de chaque échantillon dans un tube PCR stérile comme solution de secours au cas où la PCR devrait être répétée.
3. Préparez la réaction de PCR (voir la table des matériaux pour le kit de PCR) en ajoutant 20 μL d’ADNc (produits de l’étape 8), 1 μL d’amorce directe de 2,5 μM, 1 μL d’amorce inverse de 2,5 μM, 25 μL de tampon d’ADN polymérase, 2 μL d’eau sans RNase et 1 μL d’ADN polymérase.
   REMARQUE : Les réactifs peuvent être transformés en mélange maître pour faciliter le traitement des échantillons. N’ajoutez pas d’ADN polymérase au mélange maître.
4. Effectuer une PCR avec une dénaturation initiale à 94 °C pendant 1 min, suivie de 18 cycles de dénaturation à 98 °C pendant 20 s - recuit à 58 °C pendant 20 s - extension à 68 °C pendant 1 min.
   REMARQUE : Ne pas amplifier la PCR au-delà de la plage linéaire. Un total de 18 cycles sera optimal pour la plupart des expériences, mais cela peut dépendre du contexte.
5. Vaporisez les produits de PCR à moins de 25 μL, puis ajoutez de l’eau sans RNase pour ramener le volume à 25 μL. Transférez 5 μL des produits PCR dans un tube stérile de 0,5 ml pour vérifier la distribution granulométrique (voir l’étape 9.6). Conservez les 20 μL restants des produits PCR à -20 °C jusqu’à ce que les étapes suivantes se succèdent.
6. Vérifiez la distribution de la taille des produits PCR comme décrit ci-dessous.
   1. Préparez du gel d’agarose à 3 % dans un tampon TAE.
      REMARQUE : Dans le présent protocole, le bromure d’éthidium (EtBr) est utilisé pour la coloration sur gel après électrophorèse (voir l’étape 9.6.5). Des colorants d’ADN appropriés peuvent être ajoutés à la solution de gel à cette étape ou utilisés pour la coloration du gel plus tard.
   2. Mélangez 1 μL de colorant de chargement 6x dans 5 μL de produits PCR (à partir de l’étape 9.5) et chargez le gel avec le mélange.
   3. Chargez 5 μL d’échelles d’ADN dans le puits avant le premier échantillon et dans le puits après le dernier échantillon. Utilisez des échelles d’ADN de 50 pb ou 100 pb pour permettre une meilleure discrimination granulométrique des produits PCR entre 150 pb et 300 pb.
   4. Exécutez une électrophorèse sur gel pour localiser les produits PCR. La condition d’exécution appropriée peut dépendre du contexte. Ici, fonctionnement à 120 V, 400 mA pendant 75 min pour une plaque de gel de 17,78 cm (largeur) x 10,16 cm (hauteur) x 1 cm (épaisseur).
   5. Placez le gel dans une boîte et remplissez la boîte d’eau déminéralisée (DI) jusqu’à ce que le gel soit complètement immergé. Ajoutez 10 μL d’EtBr dans l’eau DI en imbibant le gel. Enveloppez la boîte de papier d’aluminium et placez-la sur un shaker. Colorez le gel pendant 30 min en le secouant.
   6. Jetez les déchets contenant de l’EtBr dans une bouteille à déchets placée dans une hotte. Rincez une fois le gel avec de l’eau DI et jetez l’eau contenant de l’EtBr dans la bouteille à déchets.
   7. Remplissez la boîte d’eau DI jusqu’à ce que le gel soit complètement immergé. Enveloppez la boîte de papier d’aluminium et placez-la sur un shaker. Lavez le gel pendant 10 min en le secouant.
   8. Jetez l’eau contenant de l’EtBr dans la bouteille à déchets de la hotte. Utilisez un imageur gel pour visualiser les bandes. Acquérez une image haute résolution du gel.

10. Purification du gel

1. Préparez du gel d’agarose à 3 % dans un tampon TAE. Préparez un gel de 1 cm d’épaisseur à l’aide de peignes larges (1 mm d’épaisseur, 5 mm de largeur et 15 mm de profondeur), de sorte que chaque puits puisse contenir au moins 25 μL de mélange de colorants pour le chargement de l’échantillon.
2. Mélangez 4 μL de colorant de chargement 6x avec 20 μL de produits PCR (à partir de l’étape 9.5) et chargez le gel avec le mélange. Laissez des voies vides entre les échantillons pour minimiser la contamination croisée lors de l’excision du gel.
3. Chargez des échelles d’ADN, exécutez l’électrophorèse du gel, colorez et lavez le gel, et prenez des images de gel comme décrit à l’étape 9.6.
4. Retirez les blocs de gel contenant des produits PCR dans la plage de taille cible. Pour minimiser la contamination par des dimères d’amorce (175 pb sans inserts), extrayez les produits PCR d’une taille supérieure à 195 pb (175 pb + 20 pb de miARN).
5. Purifier les produits PCR par extraction sur gel. Utilisez un kit d’extraction de gel (voir tableau des matériaux). Le protocole de purification est basé sur le protocole du fabricant, avec des modifications mineures pour la compatibilité AQRNA-seq. Toutes les étapes de centrifugation doivent être effectuées à 17 900 x g pendant 1 min à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse à température ambiante, sauf indication contraire. Suivez les étapes décrites ci-dessous.
   1. Mesurez le poids des blocs de gel à l’intérieur des tubes. Ajoutez 6 volumes de Buffer QG (fourni dans le kit) à 1 volume de bloc de gel (1 mg de gel équivaut à environ 1 μL).
   2. Incuber à 50 °C pendant 10 min ou jusqu’à dissolution complète des blocs de gel. Tubes vortex toutes les 2 min pour faciliter la dissolution du gel. Après avoir dissous le gel, le mélange doit ressembler à la couleur du tampon QG sans le gel dissous. Si la couleur est orange ou violette, ajoutez 10 μL d’acétate de sodium 3 M (pH = 5,0) et mélangez soigneusement.
   3. Ajoutez 1 volume de gel d’isopropanol au mélange et mélangez soigneusement. Placez une colonne d’essorage dans un tube de prélèvement de 2 mL (fourni dans la trousse).
   4. Pour lier l’ADN, appliquez l’échantillon (jusqu’à 750 μL à chaque fois) dans la colonne et la centrifugeuse. Jetez le flux continu et remettez la colonne dans le même tube de collecte. La quantité maximale de gel par colonne d’essorage est de 400 mg.
   5. Ajoutez 500 μL de Buffer QG dans la colonne et la centrifugeuse. Jetez le flux continu et remettez la colonne dans le même tube de collecte.
   6. Pour laver les impuretés, ajoutez 750 μL de tampon PE (fourni dans le kit) dans la colonne, laissez reposer la colonne pendant 5 min et centrifugez. Jetez le flux continu et remettez la colonne dans le même tube de collecte. Centrifugez à nouveau pour éliminer le tampon de lavage résiduel.
   7. Placez la colonne dans un tube stérile de 1,5 ml. Pour éluer l’ADN, ajoutez 30 μL de tampon EB (fourni dans le kit) au centre de la membrane de la colonne, laissez la colonne reposer pendant 4 minutes et centrifugez.
   8. Accélérez et remettez en suspension les produits PCR purifiés en gel dans 12 μL de tampon EB.
6. Mesurer la concentration des banques construites par spectrophotométrie UV-Visible et/ou quantification fluorométrique.

11. Séquençage de la bibliothèque

1. Soumettez les bibliothèques construites à un centre de séquençage externe pour l’évaluation de la qualité et le séquençage Illumina. Pour garantir une sensibilité suffisante dans la cartographie quantitative des petits paysages d’ARN, optez pour un séquençage à extrémité appariée avec des lectures de 75 pb dans chaque direction (c’est-à-dire PE75), visant au moins 1,5 M de lectures de séquences brutes dans chaque direction pour chaque échantillon. Utilisez des amorces personnalisées (Tableau 1) pour le séquençage NextSeq, mais cela est facultatif pour le séquençage sur MiSeq.
   REMARQUE : Le séquençage peut être effectué à l’aide des plateformes MiSeq ou NextSeq500. Le choix de la plate-forme peut dépendre de la nature des échantillons et du nombre total d’échantillons.

12. Pipeline d’analyse de données

REMARQUE : La figure 2 fournit une illustration graphique des procédures simplifiées impliquées dans le pipeline d’analyse de données, qui prend des lectures de séquences brutes (au format FASTQ) comme entrée et génère une matrice d’abondance avec des lignes représentant les membres de petites espèces d’ARN d’intérêt et des colonnes représentant des échantillons. Pour le séquençage à extrémités appariées, chaque échantillon correspond à deux fichiers FASTQ, l’un pour les lectures directes et l’autre pour les lectures inverses. Le pipeline complet d’analyse de données, avec tous les scripts associés et un manuel avec des annotations détaillées pour chaque étape, est disponible sur GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git).

1. Récupérez les lectures de séquences brutes à partir du centre de séquençage externe et évaluez la qualité du séquençage à l’aide de programmes open source tels que FastQC¹⁴ ou fastp¹⁵.
2. Créez une bibliothèque de séquences de référence au format FATA.
   REMARQUE : La clé de l’adaptabilité du pipeline à diverses classes de petits ARN est une bibliothèque de séquences de référence appropriée. Pour obtenir des estimations précises de l’abondance des membres de classes d’ARN d’intérêt spécifiques (par exemple, les miARN), les utilisateurs doivent méticuleusement organiser une bibliothèque de séquences de référence à utiliser avec le pipeline. Toutes les autres instructions pour l’exécution du pipeline restent cohérentes entre les différentes petites classes d’ARN.
3. Créez un répertoire nommé AQRNA-seq pour implémenter le pipeline d’analyse de données et placez tous les scripts, les lectures de séquences filtrées en qualité et la bibliothèque de séquences de référence dans ce répertoire. Suivez les instructions détaillées sur GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git) pour préparer les sous-répertoires et apporter les modifications essentielles aux fichiers pour cibler différents organismes et/ou petites espèces d’ARN, ainsi que la compatibilité du système d’exploitation et/ou du planificateur de tâches.
4. Implémentez le pipeline d’analyse de données en suivant les étapes décrites dans le manuel sur GitHub (https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git), qui contient des descriptions, des fichiers d’entrée et de sortie, ainsi que des lignes de commande pour chaque étape. En résumé, le pipeline comprend (i) le découpage des séquences de liaison et des nucléotides aléatoires à partir des lectures, (ii) le filtrage des lectures en fonction de leur longueur, (iii) la mise en correspondance des lectures avec les séquences de référence, (iv) la résolution des correspondances ambiguës et (v) la génération de la matrice d’abondance.

Résultats

Mycobacterium bovis La souche 1173P2 du BCG (bacilles de Calmette et Guérin) subissant une croissance exponentielle a été soumise à une série chronologique (0, 4, 10 et 20 jours) de privation en nutriments, suivie d’une réanimation de 6 jours dans un milieu riche en nutriments, comme présenté précédemment dans Hu et ^al.7. De petits ARN ont été isolés à partir d’une culture bactérienne, avec trois réplicats biologiques, à chacun des cinq points temporels désignés. Le...

Discussion

Le flux de travail de préparation de la banque AQRNA-seq est conçu pour maximiser la capture d’ARN dans un échantillon et minimiser la chute de polymérase lors de la transcription inverse⁷. Grâce à une ligature de liaison en deux étapes, de nouveaux oligonucléotides d’ADN (Linker 1 et Linker 2) sont ligaturés en excès pour compléter pleinement l’ARN de l’échantillon. Les agents de liaison en excès peuvent être éliminés efficacement avec RecJf, une exonucléase de 5' à 3' s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	75890	Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F2262	Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure	Sigma-Aldrich	E7023	The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (component #: N0556SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)	New England Biolabs	M0264L (component #: M0264LVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)	New England Biolabs	M0314L (component #: M0314LVIAL)	Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)	New England Biolabs	M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)	New England Biolabs	M0202L (component #: M0202LVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0202L (component #: B0202SVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)	New England Biolabs	M0437M (component #: M0437MVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (component #: B0216SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)