Perfusion chirurgicale et isolement du pancréas porcin pour l’isolement des îlots

Résumé

Ce protocole fournit un guide étape par étape pour l’obtention d’un pancréas porcin pour l’isolement et la purification des îlots de Langerhans.

Résumé

La transplantation d’îlots pancréatiques est un traitement émergent du diabète de type I ; Cependant, il est limité par l’appariement des donneurs et la disponibilité. La xénotransplantation d’îlots porcins offre une alternative prometteuse à l’allotransplantation, avec un potentiel de production à grande échelle d’îlots fonctionnels à la demande. Le rendement et la viabilité des îlots isolés sont très sensibles à la qualité du pancréas du donneur et à la méthode d’obtention, en particulier à la durée de la période d’ischémie chaude. Pour améliorer la préservation des organes ainsi que le rendement et la viabilité ultérieurs des îlots, nous avons développé un protocole de perfusion chirurgicale et de résection du pancréas porcin. Ce protocole utilise la canulation aortique infrarénale directe et la perfusion d’organes pour minimiser le temps d’ischémie chaude et simplifier la procédure pour les opérateurs qui n’ont pas une expertise chirurgicale approfondie. La perfusion artérielle ultérieure du pancréas via l’aorte évacue le sang stagnant de la microvascularisation, réduisant ainsi la thrombose et les dommages oxydatifs aux tissus. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour la perfusion chirurgicale et la résection du pancréas porcin, suivies de l’isolement et de la purification des îlots.

Introduction

Le diabète de type 1 est causé par la destruction auto-immune des cellules bêta pancréatiques¹. Par conséquent, les patients sont dépendants de l’insuline exogène, ce qui les expose à des fluctuations glycémiques à haut risque avec des épisodes d’hyperglycémie et d’hypoglycémie². L’allotransplantation d’îlots est un remède potentiel contre le diabète de type I ; Cependant, la disponibilité limitée de donneurs d’organes pancréatiques demeure un obstacle majeur à l’adoption généralisée de la procédure ^2,3. La xénotransplantation d’....

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux sont approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de la Division de médecine comparative de la faculté de médecine de l’Université de Washington. Les porcs Yorkshire adultes pesant de 35 à 35 kg sont idéaux pour cette procédure ; Cependant, le protocole peut être adapté pour des porcs de différentes tailles en fonction du contexte expérimental. L’ensemble de la procédure doit être effectué de manière stérile dans une salle d’opération.

1. Préparation préopératoire et anesthésie

1. Sédatez le porc ave....

Discussion

La xénotransplantation d’îlots pancréatiques avec des donneurs porcins est une stratégie prometteuse pour le traitement du diabète de type I. L’isolement des îlots est difficile, et la viabilité et le rendement finaux des îlots sont très sensibles à l’hypotension et à l’ischémie tissulaire rencontrées lors de l’approvisionnement en organes^16,17. Pour optimiser l’approvisionnement et la préservation du pa.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M NaOH, 100 mL	Millipore Sigma	1310-73-2
10x HBSS, 500 mL (15 to 30 °C)	Thermo Fisher	14065056
1x D-PBS, 500 mL	Thermo Fisher	14200075
1x HBSS, 1 L	Thermo Fisher	14025076
250 mL Conical Tubes	Millipore Sigma	CLS430236-6EA
Amphotericin B [50 mg]	Millipore Sigma	PHR1662
Antiseptic Povidone Iodine 10%	Millipore Sigma	25655-41-8
BioRad Gradient Former	BioRad	395
Calcium Chloride dihydrate	Thermo Fisher	10035-04-8
COBE Cell Processor	Ebay	317690
Digestion circuit reservoir, Gibco bottle, 1 L	Thermo Fisher	10341001
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Thermo Fisher	85190
Dithizone	Thermo Fisher	60-10-6
Gradient Former Connection Kit	BioRad	1652008
Heparin [1000 U/mL]	Emergency Medical Products	0409-2720-01
HEPES Buffer (1 M), 100 mL	Thermo Fisher	15630080
Human Serum Albumin 25%, 100 mL	Celprogen	HSA2001-25-1
Isoflurane	Covetrus	Item#:11695067772
Ketamine	Patterson	Item #:07-894-8462
Liberase (100 mg)	Millipore Sigma	5401020001
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher	L3224
Lympholyte 1.1 Media 500 mL	Cedarlane Labs	CL5020
Masterflex LS 16 Tubing	Masterfle	96419-16
Masterflex Peristaltic Pump	Masterflex	07522-30
PenStrep (2 mg/mL)	Celprogen	PS-30-002
Pulmozyme (1 mg/mL, 2.5 mL/vial)	Dornase Alfa	8931278
Recovery Medium, PIM(R)	Prodo Laboratories, Inc.	PIM-R001GMP
RPMI 1640	Millipore Sigma	R8758-1L
Standard Culture Medium, PIM(S)	Prodo Laboratories, Inc.	PIM-S001GMP
Tzed™ (tiletamine and zolazepam) Injection C	Patterson	Item #:07-894-6240
University of Wisconsin (UW) Solution, 3 L	Global Transplant Solutions	1000-0046-06
Waterbath	Sigma Alderich	CLS6783-1EA
Xylazine	Patterson	Item #:07-891-6165