MLH1 Expression génique dans le sang périphérique chez les patients atteints de cancer du côlon et leur association avec le cancer du côlon

Résumé

Cette étude examine l’association entre l’expression du gène MLH1 dans le sang périphérique et le cancer du côlon, en utilisant une approche cas-témoins pour comparer les niveaux d’expression chez les patients et les témoins sains appariés.

Résumé

L’homologue 1 de MutL (MLH1) est un composant du complexe hétérodimérique MutLα qui détecte et corrige les mésappariements base-base et les boucles d’insertion/délétion causées par la méincorporation de nucléotides. En l’absence de la protéine MLH1, la fréquence des mésappariements non réparés augmente, ce qui entraîne un cancer de l’organe. L’étude actuelle visait à quantifier l’expression du gène MLH1 et sa relation avec l’invasion tumorale (T) et l’invasion des ganglions lymphatiques (N) dans des échantillons de sang de patients atteints de cancer colorectal (CCR). Des échantillons de sang ont été prélevés chez 36 patients atteints de CCR. L’ARN a été extrait et l’ADNc a été synthétisé à l’aide d’un kit. Les amorces ont été construites à l’aide de l’approche de la jonction exon-exon, et les gènes MLH1 et β-actine ont été testés 3x à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase en temps réel (PCR en temps réel). Un logiciel d’analyse de l’expression génique a été utilisé pour analyser les données, et un test t a été utilisé pour examiner l’expression de MLH1 et sa connexion avec les variables T et N. Dans cette étude, 36 patients atteints d’un cancer colorectal, dont 15 (41,6 %) femmes et 21 (58,4 %) hommes, âgés en moyenne de 57,35 ± 4,22 ans et âgés de 26 à 87 ans, ont été inclus. Les résultats ont montré que le rapport d’expression du gène MLH1 chez les patients diminuait par rapport à celui des individus sains, et que la diminution de l’expression des gènes à différents stades de la maladie était significative. Les résultats de cette étude ont montré que la réduction de l’expression du gène MLH1 joue un rôle efficace dans le développement du CCR.

Introduction

Le cancer du côlon (CCR) est l’un des types de cancer les plus courants. C’est la quatrième cause de décès par cancer dans le monde¹. Le CCR est plus fréquent chez les hommes que chez les femmes, et il est trois à quatre fois plus fréquent dans les pays industrialisés que dans les pays en développement. Le taux d’incidence normalisé selon l’âge (global) pour 1 x 10⁵ d’incidences de CCR est de 19,7 chez les deux sexes, de 23,6 chez les hommes et de 16,3 chez les femmes². Des études épidémiologiques ont montré de fortes associations environnementales et de mode de vie avec le CCR. L’obésité, la viande rouge ou transformée, le tabac, l’alcool, le traitement par privation androgénique et la cholécystectomie sont tous associés à une augmentation modeste des risques de CCR ^2,3.

L’instabilité chromosomique, l’instabilité des microsatellites et le phénotype de méthylateur de l’îlot CpG (CIMP) jouent un rôle important dans la tumorigenèse du CRC⁴. Selon des études antérieures, environ 250 mutations différentes ont été identifiées chez des patients atteints de CCR, ce qui équivaut à environ 55 % des mutations connues liées aux gènes de réparation des mésappariements de l’ADN (MMR). Les défauts dans les protéines de réparation des mésappariements peuvent être causés par des mutations germinales dans les gènes MSH6, MLH1, PMS2 et MSH2, et la plupart de ces mutations se trouvent dans les gènes MLH1 et MSH2 ^4,5. La protéine la plus importante du système MMR, qui est généralement impliquée dans le CCR, est MLH1. Des études récentes ont montré que tout changement dans l’expression de MLH1 peut augmenter le risque de CCR. Les mutations germinales de MLH1 sont responsables du syndrome de Lynch, un type héréditaire de CCR. De plus, 13 à 15 % des cas de cancer du côlon diffus sont causés par un déficit en MLH1 basé sur l’hyperméthylation du promoteur somatique ^6,7,8.

Le gène MLH1 est situé sur le bras court du chromosome 3 en position 22.2 et contient 21 exons⁹. La protéine codée par le gène MLH1 peut coopérer avec une endonucléase impliquée dans la réparation des mésappariements, PMS2, pour générer MutLα, qui fait partie du système MMR. MutLα est principalement impliqué dans la réparation des mésappariements base-base et des boucles de délétion et d’addition à la suite d’une réplication incomplète de l’ADN. De plus, la protéine codée est impliquée dans la signalisation des dommages à l’ADN et peut être convertie en forme ɣMutL avec la protéine MLH3, qui est impliquée dans la réparation des mésappariements de l’ADN observée dans la méiose 10,11,12. Des études ont montré que MLH1 est impliqué dans d’autres activités cellulaires majeures, notamment la régulation des points de contrôle du cycle cellulaire, l’apoptose, la recombinaison croisée et l’incompatibilité mitotique¹³.

Le gène MLH1 joue un rôle clé dans le système de réparation des mésappariements de l’ADN (MMR). Un défaut de fonction de ce gène peut entraîner l’accumulation de mutations génétiques et, par conséquent, le développement d’un cancer colorectal¹⁴. Des études antérieures ont montré qu’environ 55 % des mutations associées aux gènes MMR chez les patients atteints de CCR sont liées à des mutations du gène MLH1. De plus, une diminution de l’expression du gène MLH1 peut conduire au syndrome de Lynch, qui est une forme héréditaire de cancer colorectal^15,16. De plus, une anomalie du gène MLH1 basée sur l’hyperméthylation du promoteur somatique a été observée dans 13 à 15 % des cas sporadiques de cancer colorectal¹⁷. Ces preuves scientifiques montrent que le gène MLH1 agit comme un biomarqueur important dans le cancer colorectal, et son analyse de l’expression peut fournir des informations précieuses sur la fonction de la voie ROR et le risque génétique de CRC¹⁸. La mesure des niveaux d’expression de MLH1 dans le sang périphérique des patients atteints d’un cancer du côlon peut fournir des informations précieuses sur la fonctionnalité de la voie MMR, qui est souvent perturbée dans le cancer du côlon. Cette méthode peut être utilisée à des fins pronostiques et pour comprendre la susceptibilité génétique au cancer du côlon^19,20. Une étude sur la relation entre la mutation du locus G à C de MLH1 415 et le cancer colorectal sporadique chez les patients chinois a révélé que la fréquence du génotype C/C de MLH1 était significativement plus élevée chez les patients atteints de CCR sporadique que chez les témoins, suggérant une susceptibilité génétique au CCR sporadique chez les patients chinois²¹. Une autre étude a comparé l’expression génique des biomarqueurs génétiques du CCR dans le sang périphérique et les échantillons de biopsie de patients atteints de maladies inflammatoires de l’intestin (MICI), soulignant le potentiel de l’analyse de l’expression génique du sang périphérique pour comprendre les biomarqueurs liés au cancer du côlon²².

Compte tenu du rôle important du gène MLH1 et des études menées au cours des dernières décennies avec l’analyse moléculaire par profilage de l’expression de l’ARNm, les cancers ont été classés avec une plus grande précision. Le but de cette étude était d’étudier quantitativement l’expression de MLH1 dans des échantillons de sang périphérique de patients atteints de CCR à l’aide de la PCR en temps réel, et d’étudier sa relation avec les facteurs pathologiques, les stades de progression tumorale vers les couches de la paroi intestinale (T) et les stades d’invasion des ganglions lymphatiques (N). Cette étude a été menée chez 36 patients atteints de CCR afin d’établir des changements quantitatifs dans l’expression des gènes en tant que biomarqueurs pour le dépistage, le pronostic et le diagnostic du CCR à l’aide d’échantillons de sang périphérique.

Protocole

Une recherche cas-témoins a été menée à l’hôpital affilié 2 de l’Université de Nantong entre avril 2021 et mai 2023. S’engager auprès du service administratif de l’hôpital pour établir le cadre de l’étude. L’approbation éthique a été obtenue en soumettant la proposition d’étude au comité d’éthique de l’Université de Nantong. Des directives éthiques ont été suivies pour assurer la confidentialité et le consentement éclairé.

1. Recrutement des patients et conception de l’étude

1. Échantillonnage pour l’inclusion des participants à l’étude
   1. Étudier l’expression du gène MLH1 dans le sang périphérique de 36 personnes atteintes d’un cancer du côlon et d’un groupe témoin. Élaborez des critères d’inclusion et d’exclusion clairs pour la sélection des participants.
   2. Recruter des personnes diagnostiquées avec des types spécifiques de cancer du côlon (cancers du côlon rectosigmoïde, cæcum, ascendant, transverse et descendant qui étaient considérées comme ayant des tumeurs colorectales) et ont obtenu un consentement éclairé.
   3. Exclure les personnes ayant d’autres diagnostics de cancer ou des affections qui pourraient fausser l’analyse de l’expression génétique. De plus, excluez les participants ayant des antécédents de transfusion sanguine au cours des 3 derniers mois, des antécédents de chimiothérapie ou de radiothérapie au cours des 6 derniers mois, des antécédents de consommation d’alcool ou de drogues et des antécédents de maladies auto-immunes ou de maladies inflammatoires de l’intestin.
2. Catégorisez les facteurs de risque cliniques en fonction du système de stadification TNM (tumeur, ganglions et métastases), en tenant compte de la masse cancéreuse, de la taille de la tumeur et de l’invasion des organes adjacents^23,24.
   1. Divisez les différents stades du cancer (0-4) en fonction des données disponibles du fichier de pathologie.
   2. Segmentez le taux de croissance et de progression tumorale dans les couches de la paroi intestinale (indice T) en quatre groupes distincts (T1-4, T0-TX) et l’invasion des ganglions lymphatiques (indice N) en quatre groupes (N1-3, N0-NX).
3. Préparez un groupe témoin avec des individus en bonne santé.
   1. Associez le groupe témoin au groupe de patients en termes d’âge et de sexe. Recueillez des données démographiques détaillées pour chaque participant afin d’assurer la comparabilité.
4. Processus de consentement éclairé
   1. Préparez des documents de consentement éclairé qui expliquent l’objectif de l’étude, les procédures et les risques potentiels.
   2. Engagez-vous avec les participants, en leur donnant suffisamment de temps pour poser des questions. Rassemblez les formulaires de consentement éclairé signés avant de procéder au prélèvement des échantillons.

2. Extraction et purification de l’ARN

1. Prélèvement d’échantillons de sang périphérique
   1. Procurez-vous des tubes revêtus d’EDTA disponibles dans le commerce et certifiés pour une utilisation clinique ou en laboratoire. Vérifiez la date de péremption des tubes. Vérifiez l’intégrité de l’emballage du tube.
   2. Demandez au participant de s’asseoir confortablement. À l’aide d’une seringue stérile, prélevez 5 ml de sang dans la veine antécubitale. Assurez-vous que le participant est détendu, le bras tendu pour exposer la veine. Transférez immédiatement les échantillons de sang dans les tubes préparés, en assurant une exposition minimale à l’air.
   3. Maintenir les échantillons à 4 °C pendant le transport vers le laboratoire afin de préserver l’intégrité de l’ARN.
2. Utilisez un mini-kit de sang d’ARN pour l’isolement de l’ARN en suivant les instructions du fabricant.
   1. Brièvement, lyse les globules rouges en incubant l’échantillon de sang entier avec Buffer EL sur de la glace. Centrifuger pour granuler les leucocytes et jeter le surnageant. Lysez les leucocytes avec Buffer RLT et homogénéisez le lysat à l’aide d’une colonne de broyage.
   2. Ajouter l’éthanol au lysat homogénéisé et transférer dans une colonne de spin. Lavez la colonne avec le tampon RW1 et le tampon RPE. Éluer l’ARN purifié en ajoutant de l’eau exempte de RNase dans la colonne et en centrifugant.
3. Évaluation de la quantité et de la qualité de l’ARN
   1. Quantification de l’ARN : Utilisez un spectrophotomètre pour mesurer la concentration et la pureté de l’ARN. Ouvrez le logiciel sur l’ordinateur connecté. Sélectionnez l’option Acide nucléique dans le menu principal. Appliquez 1 μL d’échantillon d’ARN sur la zone de l’échantillon.
   2. Tester la pureté et l’intégrité de l’ARN
      REMARQUE : L’intégrité et la distribution granulométrique de l’ARN total purifié avec le mini-kit d’ARN sanguin peuvent être vérifiées par spectrophotométrie et électrophorèse sur gel. Les ARN ribosomales doivent apparaître sous forme de bandes ou de pics pointus. Le rapport apparent entre l’ARNr 28S et l’ARNr 18S doit être d’environ 2:1. Si les bandes ribosomiques ou les pics d’un échantillon spécifique ne sont pas pointus mais apparaissent comme une tache vers des ARN de plus petite taille ; il est probable que l’échantillon ait subi une dégradation majeure avant ou pendant la purification de l’ARN.
      1. Pour la mesure par spectrophotométrie, abaissez le bras de l’appareil et cliquez sur Mesurer pour obtenir le rapport A260/A280. Évaluer la pureté de l’échantillon d’ARN, en visant un rapport A260/A280 compris entre 1,8 et 2,0.
      2. Effectuez une électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % comme décrit ci-dessous.
         1. Préparez la solution d’agarose à 1 % en chauffant la poudre d’agarose dans un tampon TAE jusqu’à ce qu’elle soit dissoute. Ajouter du bromure d’éthidium à la solution d’agarose pour obtenir une concentration finale de 0,5 μg/mL. Versez la solution de bromure d’agarose et d’éthidium dans un plateau de coulée de gel et laissez-la se solidifier.
            REMARQUE : Le bromure d’éthidium est un colorant fluorescent qui s’intercale avec l’ARN pour permettre la visualisation sous lumière UV.
         2. Mélangez les échantillons d’ARN avec un colorant de charge et chargez-les soigneusement dans les puits du gel solidifié. Faites fonctionner l’électrophorèse sur gel à 100 V pendant environ 30 minutes pour séparer les fragments d’ARN par taille. Visualisez les bandes d’ARN en plaçant le gel sur un transilluminateur UV ou un système d’imagerie, ce qui provoque la fluorescence de l’ARN coloré au bromure d’éthidium.
4. Stockage de l’ARN extrait
   1. Prélever les échantillons d’ARN extraits. Aliquote l’ARN dans des tubes de microcentrifugation stériles, en utilisant des volumes de 10 μL par aliquote. Conservez les aliquotes d’ARN à -80 °C ou moins.
5. Transcription inverse de l’ARN en ADNc
   1. Suivez le protocole du kit de transcription inverse. Décongelez et préparez les réactifs nécessaires sur de la glace et à température ambiante.
   2. Effectuez une réaction d’élimination de l’ADN génomique pour éliminer toute contamination par l’ADN génomique.
   3. Préparez le master mix de transcription inverse sur glace, qui contient tous les composants sauf l’ARN matrice.
   4. Ajoutez l’ARN matrice de l’étape d’élimination de l’ADN au mélange maître de transcription inverse. Incuber la réaction de transcription inverse à 42 °C pendant 15 min.
   5. Inactiver l’enzyme transcriptase inverse en l’incubant à 95 °C pendant 3 min. Utilisez une aliquote de l’ADNc fini pour une PCR immédiate en temps réel ou stockez l’ADNc à -20 °C pour une utilisation ultérieure.

3. Conception d’amorce pour la PCR en temps réel

1. Sélection des gènes cibles et contrôles internes
   1. Choisissez le gène MLH1 comme cible de quantification en raison de son association avec le cancer du côlon. Sélectionnez β-actine comme contrôle interne pour la normalisation des données d’expression génique.
2. Processus de conception de l’apprêt
   1. Lancez le logiciel de conception d’amorces et saisissez la séquence génétique de MLH1 obtenue à partir de l’Ensemble ou de l’UCSC Genome Browser.
   2. Réglez la température de fusion (Tm) pour les amorces entre 58 et 60 °C, la teneur optimale en GC entre 40 % et 60 % et la longueur de l’amorce entre 18 et 24 nucléotides.
   3. Entrez les séquences d’amorces conçues dans la base de données NCBI BLAST pour confirmer la spécificité.
      1. Allez sur le site Web de BLAST, sélectionnez Nucleotide BLAST. Collez les séquences d’amorce dans la zone de recherche et cliquez sur BLAST.
      2. Analysez les résultats pour vous assurer qu’aucune amplification hors cible n’est prévue. Voir le tableau 1 pour plus de détails.

4. PCR en temps réel

1. Configuration de la réaction PCR en temps réel. Voir le tableau 2 pour plus de détails.
   1. Centrifuger les réactifs à 4 °C pendant 5 min à 10 000 x g pour recueillir le contenu au fond des tubes.
   2. Préparez un master mix selon le protocole du kit commercial, qui comprend le SYBR Green, le tampon, les dNTP, le MgCl₂ et la Taq polymérase.
   3. Répartissez le mélange maître dans des tubes PCR étiquetés, en garantissant la cohérence du volume entre les échantillons.
   4. Ajoutez le volume approprié d’amorces avant et inverse pour MLH1 et β-actine dans leurs tubes respectifs.
   5. Diluez les échantillons d’ARN à une concentration constante de 100 ng/μL avant la transcription inverse et transcrivez inversement en ADNc à l’aide d’un kit de transcription inverse.
2. Amplification et collecte de données
   1. Placez les tubes PCR dans le système de PCR en temps réel.
   2. Programmez le thermocycleur avec les conditions de cycle optimisées : 95 °C pendant 20 s pour la dénaturation, 54 °C pendant 30 s pour le recuit et 72 °C pendant 30 s pour l’extension. Voir le tableau 3 pour plus de détails.
   3. Réglez la machine pour qu’elle fonctionne pendant 45 cycles.
   4. Surveillez la réaction en temps réel sur l’interface logicielle du système, en observant les courbes d’amplification de chaque échantillon.
   5. Incluez un témoin négatif sans ADNc pour vérifier la contamination. Répétez l’exécution PCR 3 fois pour chaque échantillon afin de garantir la fiabilité des données.
3. Analyse des données
   1. Une fois les cycles terminés, utilisez le logiciel du système pour analyser les valeurs de cycle de seuil (Ct). Exportez les valeurs Ct vers un tableur pour une analyse plus approfondie.
   2. Calculer l’expression relative des gènes à l’aide de la méthode ^{2-ΔΔCt 25}, en normalisant les données au contrôle β-actine.

5. Immunohistochimie et analyses génétiques

1. Effectuer une immunohistochimie sur des coupes de tissus pour corréler l’expression de la protéine MLH1 avec les niveaux d’expression génique.
   1. Préparez des lames de tissus et appliquez l’anticorps anti-MLH1.
   2. Utilisez un kit d’anticorps secondaires conjugués à la HRP et de substrat DAB (3,3'-Diaminobenzidine). Développez des lames selon les instructions de la trousse et analysez-les avec un microscope optique.
2. Effectuer des tests de PCR et d’instabilité des microsatellites spécifiques à la méthylation pour différencier le syndrome de Lynch du CCR sporadique.
   1. Utilisez un kit d’extraction d’ADN commercial. Suivez le protocole du kit pour le sang et les tissus tumoraux.
   2. Traitez l’ADN avec un kit de conversion au bisulfite. Utilisez des amorces spécifiques à la méthylation conçues pour la région promotrice MLH1. Effectuez la PCR selon le protocole du kit.
   3. Exécutez l’électrophorèse sur gel sur les produits PCR pour visualiser l’état de méthylation.
   4. Pour le test d’instabilité des microsatellites (MSI), l’électrophorèse capillaire à l’aide d’un analyseur génétique. Comparez les longueurs des microsatellites en analysant les produits PCR marqués par fluorescence.

6. Analyse statistique

1. Utiliser un logiciel d’analyse statistique commercial pour l’analyse des données.
   1. Ouvrez le logiciel et créez un nouvel ensemble de données pour l’expression des gènes et les données démographiques.
   2. Entrez les valeurs d’expression génique relatives et les données démographiques correspondantes dans l’ensemble de données.
   3. Utilisez le test de Kolmogorov-Smirnov pour évaluer la normalité des données.
      1. Sélectionnez Analyser dans le menu supérieur, choisissez Tests non paramétriques, puis Boîtes de dialogue héritées.
      2. Cliquez sur Test de Kolmogorov-Smirnov et entrez la variable pour l’expression des gènes. Exécutez le test et interprétez le résultat en fonction de la signification de la normalité de distribution.
   4. Effectuer des tests T pour comparer l’expression du gène MLH1 entre les patients et les groupes témoins.
      1. Sélectionnez Analyser, puis Comparer les moyennes, puis choisissez Test T d’échantillons indépendants.
      2. Attribuez l’appartenance au groupe (patient ou contrôle) comme variable de regroupement et l’expression génique comme variable de test. Exécutez le test et interprétez le niveau de signification bilatéral.
   5. Calculez les changements de pliage dans l’expression des gènes à l’aide de la méthode ^2-ΔΔCt 25.

Résultats

Dans cette étude, 36 patients atteints d’un cancer du côlon ont été examinés pour l’expression du gène MLH1 dans le sang périphérique et sa relation avec le cancer du côlon. L’analyse des variables démographiques a montré que 15 patients (41,6 %) étaient des femmes et 21 patients (58,4 %) étaient des hommes. L’âge moyen des patients était de 57,35 ± 4,22 ans, et la tranche d’âge était de 26 à 87 ans. L’indice de masse corporelle (IMC) des patients ...

Discussion

Cette étude a été menée dans le but d’étudier l’expression du gène MLH1 . Dans cette étude, il a été montré que le niveau d’expression du gène MLH1 était diminué chez les personnes malades par rapport aux personnes en bonne santé. Sur la base d’études de changement de pli, il a été démontré que l’expression du gène MLH1 aux stades II, III et IV chez les personnes malades par rapport aux personnes en bonne santé présentait une dim...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose Gel Electrophoresis Equipment	Bio-Rad	Mini-Sub Cell GT Systems	Used to check RNA quality
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E9884	Used as an anticoagulant for blood samples
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-2000	Spectrophotometer used to determine RNA purity
Real-time PCR Machine	Applied Biosystems	A34322	Used for RT-PCR reactions
RNA Extraction Kit	Intron Biotechnology Co	#Cat 17061	Used for RNA extraction from blood samples
SYBR Green PCR Kit	Thermo Fisher Scientific	4309155	Reagents used for RT-PCR experiments