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  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, nous montrons le protocole d’imagerie pour l’observation des interactions biomoléculaires avec le tapping photothermique hors résonance (PORT), où nous avons optimisé les paramètres d’imagerie, identifié les limites du système et étudié les améliorations potentielles dans l’imagerie de l’assemblage de motifs d’ADN en étoile à trois points.

Résumé

La microscopie à force atomique à grande vitesse (HS-AFM) est une technique d’imagerie moléculaire populaire pour visualiser les processus biologiques d’une seule molécule en temps réel en raison de sa capacité à imager dans des conditions physiologiques dans des environnements liquides. Le mode de taraudage photothermique hors résonance (PORT) utilise un laser d’entraînement pour faire osciller le cantilever de manière contrôlée. Cet actionnement direct en porte-à-faux est efficace dans la gamme des MHz. Combiné à l’utilisation de la boucle de rétroaction sur la courbe de force du domaine temporel plutôt que sur l’amplitude de résonance, PORT permet une imagerie à grande vitesse jusqu’à dix images par seconde avec un contrôle direct des forces de l’échantillon de pointe. Il a été démontré que PORT permet l’imagerie de la dynamique d’assemblage délicate et le suivi précis des motifs formés par les biomolécules. Jusqu’à présent, la technique a été utilisée pour une variété d’études dynamiques in vitro , y compris les motifs d’assemblage d’ADN à 3 points en étoile montrés dans ce travail. Grâce à une série d’expériences, ce protocole identifie systématiquement les paramètres d’imagerie optimaux et les limites ultimes du système d’imagerie HS-PORT AFM et la manière dont ils affectent les processus d’assemblage biomoléculaire. De plus, il étudie les effets thermiques indésirables potentiels induits par le laser d’entraînement sur l’échantillon et le liquide environnant, en particulier lorsque le balayage est limité à de petites zones. Ces résultats fournissent des informations précieuses qui permettront de faire progresser l’application du mode PORT dans l’étude de systèmes biologiques complexes.

Introduction

La microscopie à force atomique à grande vitesse (HS-AFM) est une technique d’imagerie 1,2,3,4 qui se développe rapidement. Il fonctionne à des vitesses qui permettent aux chercheurs de visualiser les interactions biomoléculaires en temps réel 5,6,7,8,9. Le tapping hors résonance photothermique (PORT) est un mode d’imagerie hors résonance similaire au tapping de force de crête10,11, au mode de force pulsée12,13 ou au mode de saut14. Cependant, plutôt que d’osciller verticalement le scanner, PORT oscille verticalement uniquement le cantilever grâce à un laser d’excitation focalisé sur le cantilever (généralement près du point de serrage). Le porte-à-faux se déforme en raison de l’effet bimorphe : un laser d’excitation modulé en puissance chauffe périodiquement le porte-à-faux revêtu, qui se plie en raison des différents coefficients de dilatation thermique du porte-à-faux et des matériaux de revêtement15. Le cantilever et le chauffage de l’échantillon peuvent être minimisés en utilisant un laser d’entraînement qui est périodiquement éteint et rallumé pendant chaque cycle d’oscillation, plutôt que d’utiliser un entraînement sinusoïdal complet5.

L’ADN a été utilisé pour former des motifs biologiquement pertinents, structurellement intéressants et biochimiquement utiles pendant un certain nombre d’années16, 17, 18, 19, 20. De plus, il a été démontré que les structures de l’ADN sont parfaitement adaptées pour caractériser la qualité d’imagerie AFM21 et pour évaluer l’effet de pointe de l’AFM22 à grande vitesse. Les étoiles à trois points d’ADN à extrémité arrondie (3PS) sont devenues pratiques en tant que système modèle programmable pour étudier l’organisation supramoléculaire de molécules de structure similaire dans des systèmes biologiques autrement complexes19. Auparavant, l’auto-assemblage des réseaux formés par des monomères d’ADN trimérique à extrémité émoussée était suivi via HS-AFM23. Finalement, ceux-ci s’organisent en grands réseaux d’ordre hexagonal. Ici, l’auto-assemblage d’étoiles à 3 pointsd’ADN 19 est imagé avec la technique PORT à des vitesses de balayage suffisamment rapides pour suivre l’auto-assemblage et ses mécanismes de correction24 tout en assurant une perturbation minimale du processus ou des dommages à l’échantillon. Comme pour tout mode HS-AFM, il y a un compromis entre la qualité d’image réalisable, la vitesse d’imagerie et la perturbation indésirable de l’échantillon. En choisissant le bon compromis, on peut mieux comprendre les modèles d’auto-organisation des assemblages supramoléculaires. Ce protocole utilisera donc une configuration similaire avec DNA 3PS comme système modèle pour optimiser les paramètres spécifiques à PORT. Cela permettra de fonctionner à des vitesses d’imagerie rapides avec des tailles de balayage suffisamment grandes tout en minimisant les dommages aux échantillons.

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Protocole

1. Echantillon et tampons

REMARQUE : La tuile d’ADN utilisée dans cette étude est le motif d’étoile à 3 points développé au laboratoire Mao de l’Université Purdue19,25. Tous les oligonucléotides utilisés dans cette étude ont été achetés auprès d’Integrated DNA Technologies, Inc. Rassemblez les matériaux et les réactifs nécessaires.

  1. Mélangez les ADN monocaténaires (ADNsb) à un rapport molaire de 1:3:3 (S1 0,6 μM, 1,8 μM pour S2 et 1,8 μM pour S3) dans le tampon de recuit (5 mM TRIS, 1 mM EDTA et 10 mM MgAc2). La concentration finale du motif d’ADN doit être de 0,6 μM (49 ng/μL avec un poids moléculaire de 3PS de 82020,3 g/mol).
  2. Placez la solution d’ADN dans un récipient résistant à la chaleur et chauffez-la à 80 °C. Refroidissez lentement la solution d’ADN de 80 °C à 20 °C sur une période de 4 h. Ce processus de recuit aide les oligonucléotides d’ADNsb à former le motif d’ADN double brin souhaité.
  3. Pour la purification, chargez la solution d’ADN recuit sur un gel d’agarose à 3 % pour éliminer l’excès d’ADNsb et tout produit secondaire indésirable. Faites fonctionner le gel à 3 % à 60 V pendant environ 2,5 h dans un tampon de fonctionnement contenant 0,5x Tris-Borate-EDTA (TBE) et 10 mM Mg (CH3COO)2.
  4. Identifiez et localisez la bande sur le gel qui contient le motif d’ADN. Assurez-vous que le groupe a migré vers une position spécifique en fonction de sa taille.
  5. Excisez soigneusement la bande contenant le motif d’ADN du gel. Extrayez le motif d’ADN du fragment de gel excisé en le plaçant dans une colonne de centrifugation d’extraction de gel et en le centrifugant à 3 000 x g et 4 °C pendant 10 min.
  6. Remplacez le tampon dans le motif d’ADN extrait par le tampon de recuit à l’aide d’un concentrateur centrifuge. Centrifuger à 3000 x g à température ambiante (ou moins) jusqu’à ce que la solution concentrée soit inférieure à 100 μL. Ensuite, ajoutez 300 μL de tampon de recuit et répétez cette étape deux fois pour vous assurer que le tampon est remplacé.
  7. Diluer le motif d’ADN à 6 nM à des fins d’imagerie. Utilisez un spectrophotomètre ou d’autres méthodes appropriées pour déterminer et ajuster avec précision la concentration. Le motif de l’ADN est maintenant prêt pour l’imagerie.
    REMARQUE : Tous les tampons du protocole ont un pH de 8,0. Les informations de séquence pour les trois bandes respectives sont les suivantes :
    S1 : AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
    AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
    S2 : ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
    CGGTAACG
    S3 : CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. Croissance de la pointe en porte-à-faux

  1. Montage en porte-à-faux sur le support de porte-à-faux SEM : Assurez-vous que les porte-à-faux sont propres et exempts de tout contaminant. Montez les porte-à-faux sur un support approprié compatible avec le système SEM. La conception du support en porte-à-faux sur mesure peut être partagée sur demande.
  2. Injection de gaz : Chauffer le gaz précurseur (par exemple, le phénanthrène C14H10 précurseur pour les pointes en carbone amorphe) à utiliser sur le système d’injection de gaz pour faire pousser la nouvelle pointe. Dès que le vide est inférieur à 10-5 mbar, purgez la conduite d’injection de gaz 10 fois pendant 2 s pour vous assurer qu’il n’y a pas d’air résiduel indésirable dans la conduite de la buse (cela doit être fait avec la vanne vers la chambre du pistolet fermée).
  3. Réglage de la position de la pointe : Utilisez la microscopie électronique à balayage (MEB) pour localiser l’extrémité du cantilever. Inclinez le support en porte-à-faux à un angle (par exemple, 11° dans ce cas) équivalent à celui que le porte-à-faux présentera lorsqu’il sera placé sur le support en porte-à-faux AFM par rapport à la surface afin que l’extrémité cultivée soit perpendiculaire à la surface pendant l’imagerie. Ajustez la position et la mise au point du MEB pour obtenir une vue claire de la pointe du cantilever, où une nano-pointe de carbone pointue sera développée.
  4. Dépôt induit par faisceau d’électrons focalisé (FEBID) :
    1. Réglez les paramètres de dépôt sur le logiciel sélectionné (dans ce cas, SmartFIB), tels que le courant de faisceau (I) et la tension d’accélération (V), la distance de travail (WD), le grossissement, la forme exposée, la dose/le temps de dépôt et le temps de séjour. Les paramètres suivants ont été utilisés pour développer des pointes en carbone amorphe, qui présentent de bonnes propriétés mécaniques pour l’imagerie AFM, conduisant à des longueurs d’environ 130 nm et à des rayons dans la gamme de 2 à 4 nm :
      Sélectionnez un point/point comme forme exposée
      WD = 5 mm
      I = 78 pA et V = 5 kV
      Temps de séjour = 1 μs
      Dose = 0,05 nC et temps de dépôt = 0,64 s
      Grossissement = 20000x
    2. Commencez le processus de dépôt pour faire croître la pointe en irradiant le faisceau d’électrons à un endroit sur la pointe en porte-à-faux tout en injectant simultanément le gaz précurseur, fermant le gaz lorsque le dépôt est terminé. Dans ce cas, le logiciel SmartFIB le fait automatiquement après avoir configuré la recette mentionnée ci-dessus.
  5. Analyse post-croissance : Effectuez une imagerie MEB post-croissance pour examiner l’extrémité nouvellement cultivée et vous assurer de sa qualité et de ses caractéristiques (rayon et longueur de l’extrémité). Attendez 1 à 2 minutes après la croissance de la pointe pour vous assurer que tout le gaz précurseur est pompé afin d’éviter un redépôt pendant l’imagerie MEB. Retirez le porte-échantillon de la chambre MEB.
  6. Recyclage en porte-à-faux : Si le système MEB dispose également d’un faisceau d’ions focalisés (FIB) combiné, retirez une pointe endommagée ou sale précédemment cultivée en la fraisant avec le système FIB en utilisant de faibles courants FIB (par exemple, 1 pA, pour éviter d’endommager le porte-à-faux). Effectuez l’enlèvement de la pointe en fraisant en section transversale, de l’extrémité de la pointe à la base, pour éviter l’affaissement de la pointe. Cela permettra d’en faire repousser un nouveau.

3. Matériel HS-AFM

  1. La configuration d’imagerie est composée de la tête PORT5, 26 (Figure 1A) sur mesure, d’un scanner haute vitesse26 avec un disque d’échantillon avec mica sur le dessus, d’un contrôleur compatible27, d’un amplificateur haute tension avec la bande passante élevée requise pour l’imagerie haute vitesse, d’une base AFM et d’un PC avec le logiciel requis pour contrôler l’équipement mentionné ci-dessus27.
    REMARQUE : Dans ce cas, il s’agit de composants open-source pour lesquels des plans peuvent être obtenus auprès du Laboratoire de bio- et nano-instrumentation de l’EPFL27, 28. Il est également possible d’assister à des ateliers sur la construction de la tête et du contrôleur PORT29, ainsi que de télécharger et d’utiliser le logiciel basé sur LabView.
  2. Placez avec précaution un porte-à-faux ultra-court (par exemple, AC10DS ou équivalent) sous la pince à ressort du support en porte-porte-à-faux à l’aide d’une pince à épiler. Assurez-vous que la puce en porte-à-faux est fixe et stable.
  3. Ajouter 50 μL de liquide à l’aide d’une seringue par l’orifice d’accès au liquide gauche, comme le montre la figure 1B. Avec le laser d’excitation toujours éteint, alignez le laser de lecture sur le cantilever à l’aide des trois boutons dédiés sur la tête AFM illustrés à la Figure 1A. Pour ce faire, observez l’ombre du porte-à-faux sur un papier blanc tout en maximisant la somme (méthode de l’ombre). Ensuite, centrez le spot laser sur la photodiode à l’aide des deux boutons dédiés.
  4. Allumez et alignez le laser d’entraînement en cochant la case Activation de l’excitation dans Excitation VI, de sorte qu’il actionne et fasse osciller le cantilever. Affichez le signal d’excitation en porte-à-faux et le signal de déviation en porte-à-faux sur un oscilloscope connecté. Si l’oscillation de déflexion est trop faible (ou inexistante), il se peut que le laser d’entraînement soit très éloigné du cantilever. Dans ce cas, utilisez la méthode de l’ombre et désactivez le laser de déviation pour un alignement plus facile. Maximisez l’amplitude d’oscillation à l’aide des boutons de réglage du laser d’entraînement illustrés à la Figure 1A.
  5. Pour régler l’amplitude d’oscillation en porte-à-faux dans PORT, entrez dans la commande correspondante du logiciel la tension crête à crête envoyée au circuit de commande de la diode laser (désormais, entrée AC crête à crête) dans Excitation VI. Pour maintenir la diode laser dans le régime de conduction et, par conséquent, le laser, ajoutez une tension continue au circuit de commande de la diode laser (désormais, entrée de décalage CC), ce qui se fait également à partir d’une boîte de configuration dans Excitation VI. Les deux affecteront également la puissance du laser, qui peut être mesurée avec un wattmètre laser et est utilisée pour régler l’amplitude d’oscillation en porte-à-faux.
  6. Déterminez la fréquence maximale d’excitation photothermique qui peut être appliquée au cantilever, qui doit être inférieure à la fréquence de résonance du cantilever. Déterminez la fréquence de résonance à l’aide d’une mélodie thermique ou d’un balayage de fréquence. Les cantilevers utilisés dans cette étude (AC10DS), dont la fréquence de résonance dans les liquides est d’environ 400 kHz (1 MHz dans l’air)30, ont une région de courbure quasi statique inférieure à 300 kHz5. Ainsi, des fréquences PORT inférieures à cette limite (environ 100-200 kHz) doivent être utilisées.
  7. Ajustez les paramètres d’imagerie et les paramètres de vitesse de PORT et de vitesse de balayage aux valeurs requises dans l’excitation et le balayage visuel respectivement (les paramètres utilisés dans cet article sont indiqués dans les descriptions des figures). Une fois la configuration et les paramètres d’imagerie configurés, effectuez les expériences d’imagerie requises pour observer et suivre les interactions moléculaires.
    REMARQUE : Étant donné que les cantilevers AC10DS ne sont plus vendus, une alternative telle que Fastscan D ou BioLever31 peut devoir être utilisée jusqu’à ce qu’un équivalent soit disponible.

4. Obtenir des courbes d’interaction appropriées

  1. Dans un premier temps, approchez-vous de la surface de l’échantillon en mode contact en cliquant sur Démarrer sur le VI du contrôleur Z réglé sur le mode contact.
    1. Dans ce mode, la pointe AFM entre en contact direct avec l’échantillon. Une fois la surface atteinte, effectuez une courbe force en fonction de la distance dans la rampe VI pour obtenir l’étalonnage de la sensibilité à la déflexion en porte-à-faux.
    2. Estimez également la constante de ressort en porte-à-faux, soit à partir des spécifications du fournisseur de cantilever (moins précisément), obtenues avec un interféromètre, soit par un étalonnage basé sur la mélodie thermique après l’étalonnage de la sensibilité à la déflexion. Un étalonnage précis en porte-à-faux est essentiel pour un contrôle précis de la force de l’échantillon de pointe.
  2. Après avoir complètement rétracté le piézo Z de la surface où la pointe ne peut pas atteindre la surface en cliquant sur Haut dans le VI du contrôleur Z, passez en mode PORT dans le VI du contrôleur Z et activez le laser d’excitation dans la case à cocher VI d’excitation. Pour commencer, réglez le mode PORT pour qu’il fonctionne à la fréquence souhaitée dans Excitation VI, qui, dans ce cas expérimental, est de 100 kHz, à l’aide d’un cantilever AC10DS.
  3. Enregistrez l’oscillation sans porte-à-faux à proximité mais sans toucher la surface. Ensuite, tournez le Feedback dans le contrôleur Z ON en contact avec la surface à enregistrer et cliquez sur Corriger pour obtenir l’oscillation du cantilever lorsque le cantilever est en contact intermittent avec la surface, tous deux en nanomètres. Soustrayez la courbe d’oscillation libre de la courbe de contact intermittent pour obtenir la courbe d’interaction réelle, en les convertissant en pN à l’aide de la constante de ressort en porte-à-faux (dans ce cas, 0,1 N/m).

5. Imagerie HS-AFM

  1. Préparer une solution de Mg(CH3COO)2 à une concentration de 10 mM. À l’aide d’une seringue Hamilton, injecter 50 μL de la solution préparée de 10 mM de Mg(CH3COO)2 dans le canal fluidique du support en porte-à-faux, créant ainsi une goutte de liquide qui enveloppe le porte-à-faux.
  2. Approchez progressivement le cantilever de la surface en cliquant sur Démarrer sur le Z Controller VI. Une fois la surface détectée, activez la fonction de rétroaction et trouvez le sommet de la courbe d’interaction dans les courbes de force ORT VI. Trouvez la force de consigne la plus basse qui permet un suivi correct (en dessous de 300 pN pour éviter d’endommager les échantillons biologiques fragiles).
  3. Réglez la taille de balayage dans le VI de balayage sur 800 nm par 800 nm et le débit de ligne sur 100 Hz. Numérisez la surface en cliquant sur la flèche de l’image (vers le bas) dans le VI de balayage pour vérifier la qualité de la surface. Si des contaminations sont détectées, résolvez le problème en nettoyant la surface, le porte-à-faux et/ou le support en porte-à-faux avant de continuer.
  4. Après le balayage, rétractez le porte-à-faux de la surface en cliquant sur Retirer dans le VI du contrôleur Z. Retirez la solution tampon du trou du support en porte-à-faux à l’aide d’une seringue Hamilton pour éviter les problèmes de volume mort.
  5. Préparez une solution d’ADN 3PS dilué à partir de la partie 1 du protocole. Injectez 50 μL de la solution d’ADN 3PS dilué dans le canal dédié du support en porte-à-faux.
  6. Démarrez le processus d’imagerie en répétant les étapes 5.2 et 5.3, en balayant une zone de 800 nm sur 800 nm à une fréquence de ligne par défaut de 100 Hz (256 lignes × 256 pixels). Après le balayage initial, ajustez la taille et la vitesse de l’image dans Scan VI aux valeurs spécifiées pour une acquisition de données ultérieure.
  7. Maintenez le point de consigne de force d’entrée de l’interaction pointe-échantillon dans la boîte de point de consigne VI du contrôleur Z au niveau le plus bas requis pour un suivi correct (inférieur à 300 pN) tout au long du processus d’imagerie afin de minimiser les dommages/perturbations de l’échantillon, sauf indication contraire. Répétez ce processus pour toutes les zones d’échantillonnage requises.

6. Traitement d’image

  1. Configurez l’environnement pour l’exécution du code de traitement par lots Pygwy (Python pour Gwyddion) personnalisé, en vous assurant que Python et toutes les bibliothèques nécessaires sont disponibles. Plus d’informations peuvent être trouvées sur le site Web de Gwyddion32 sont correctement installés sur le système. Cela garantit que le code fonctionne sans problème et peut accéder aux fonctionnalités requises.
  2. Ouvrez le code de traitement par lots Pygwy personnalisé (fourni sur demande). Cela permettra d’accéder aux outils et fonctionnalités nécessaires au traitement et à l’analyse des images.
  3. Commencez le traitement de l’image en effectuant une correction de la ligne médiane horizontale sur les images. Cette étape vise à éliminer toutes les irrégularités ou artefacts présents dans les lignes de balayage, en veillant à ce que les étapes de traitement ultérieures soient basées sur des données précises. Après la suppression de l’arrière-plan du plan, appliquez la correction de ligne. Utilisez l’élimination des cicatrices pour améliorer davantage les images en éliminant toutes les marques ou imperfections indésirables causées par des facteurs externes. Cette étape améliore l’aspect visuel général des images.
  4. Améliorez la visibilité et le contraste des images en ajustant la carte de hauteur des couleurs. Cela permet de s’assurer que les caractéristiques d’intérêt sont clairement visualisées et se démarquent dans les images.
  5. Sélectionnez les images traitées qui doivent être combinées dans une vidéo. Déterminez la fréquence d’images souhaitée pour la vidéo. Dans ce cas, réglez-le sur 7 images par seconde (fps).
  6. Calculez la durée de chaque image. Utilisez Fiji (ImageJ) pour combiner les images traitées dans une vidéo. Assurez-vous que la fréquence d’images et la durée d’image sont correctement définies.

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Résultats

Dans cette étude, le processus d’assemblage dynamique de motifs d’ADN en étoiles à 3 points en îlots stables a été observé avec succès en utilisant les capacités de l’AFM HS-PORT. Cette technique nous a permis de capturer l’assemblage de ces structures en temps réel. Dans la figure 2A,B, nous obtenons une image claire à des fréquences de ligne de 100 Hz et 200 Hz, respectivement, pour une fréquence de PORT de 100 kHz (taille de balayage ...

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Discussion

Lors de l’imagerie d’échantillons biologiques délicats, les modes d’imagerie par tapotement hors résonance dans l’AFM sont particulièrement utiles car ils peuvent contrôler directement les forces d’interaction pointe-échantillon10. Parmi eux, le mode PORT se distingue par les taux d’oscillation plus élevés qu’il peut atteindre, ce qui permet des taux de balayage plus élevés. Comme PORT actionne directement et uniquement le cantilever avec u...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à révéler

Remerciements

Les auteurs remercient Raphael Zingg pour son aide dans la programmation du script Python pour le traitement des séries d’images. Le FEM prend acte du financement de H2020 - Programme-cadre de l’UE pour la recherche et l’innovation (2014-2020) ; ERC-2017-CoG ; InCell ; Numéro de projet 773091. VC reconnaît que ce projet a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 754354. Cette recherche a été soutenue par le Fonds national suisse de la recherche scientifique par le biais de la subvention 200021_182562.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AC10DSOlympusBL-AC10FS-A2Discontinued 
Biometra Compact XS/SBiometra GmbH846-025-199 Electrophoresis  unit
Biometra TRIOBiometra GmbH207072Xthermocycler for annealing
Custom AFM setupLaboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale LausanneObtainable through Laboratory for Bio-Nano Instrumentation
EDTAITW ReagentsA5097In annealing buffer
Laser Power MeterThorlabsPM100DDigital Handheld Optical Power and Energy Meter Console
Lively 3AP Power Supply, MP-310Major ScienceMP-310Electrophoresis Power Supply
MgAc2ABCR GmbHAB544692In annealing buffer
TBEThermo Scientific327330010Running buffer for electrophoresis
TRISBio-Rad1610719In annealing buffer

Références

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