Caractérisation des systèmes d’efflux multimédicamenteux chez Acinetobacter baumannii à l’aide d’une souche bactérienne déficiente en efflux et d’un système d’expression génique à copie unique

Résumé

Nous décrivons une procédure simple pour la complémentation chromosomique à copie unique d’un gène de pompe d’efflux à l’aide d’un système d’expression basé sur mini-Tn7 dans une souche modifiée d’Acinetobacter baumannii déficiente en efflux. Cet outil génétique précis permet une expression génique contrôlée, ce qui est essentiel pour la caractérisation des pompes d’efflux chez les pathogènes multirésistants.

Résumé

Acinetobacter baumannii est reconnu comme un agent pathogène à Gram négatif difficile en raison de sa résistance généralisée aux antibiotiques. Il est crucial de comprendre les mécanismes à l’origine de cette résistance pour concevoir de nouvelles options thérapeutiques efficaces. Malheureusement, notre capacité à étudier ces mécanismes chez A. baumannii est entravée par le manque d’outils de manipulation génétique appropriés. Ici, nous décrivons des méthodes d’utilisation d’un système chromosomique à base de mini-Tn7 pour obtenir l’expression génique d’une seule copie dans une souche d’A. baumannii dépourvue de mécanismes d’efflux fonctionnels de type RND. L’insertion en copie unique et l’expression inductible de la pompe d’efflux sont très avantageuses, car la présence d’opérons d’efflux RND sur des plasmides à nombre élevé de copies est souvent mal tolérée par les cellules bactériennes. De plus, l’incorporation de vecteurs d’expression mini-Tn7 recombinants dans le chromosome d’un hôte de substitution d’A. baumannii avec une sensibilité accrue à l’efflux aide à contourner les interférences d’autres pompes d’efflux. Ce système est utile non seulement pour étudier les pompes d’efflux bactériennes non caractérisées, mais aussi pour évaluer l’efficacité des inhibiteurs potentiels ciblant ces pompes.

Introduction

Acinetobacter baumannii est un agent pathogène prioritaire de l’Organisation mondiale de la santé en raison de sa résistance globale à toutes les classes d’antibiotiques¹. C’est un agent pathogène opportuniste qui touche principalement les personnes hospitalisées, blessées ou immunodéprimées. A. baumannii échappe en grande partie aux antibiotiques via des pompes à efflux, la plus pertinente étant la famille d’exportateurs Résistance-Nodulation-Division (RND)². Comprendre comment ces pompes d’efflux fonctionnent mécaniquement permettra de développer des options thérapeutiques ciblées.

Protocole

1. Préparation expérimentale

1. Purifier le plasmide pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (plasmide d’insertion, Figure 2A) avec le gène d’intérêt.
   NOTE : Ici, le gène d’intérêt est adeIJK. La concentration finale du plasmide doit être de ≥100 ng/μL.
2. Purifier le plasmide auxiliaire (pTNS2)⁹ et le plasmide d’excision (pFLP2^ab)⁶ (Figure 2B,C, respectivement), idéalement jusqu’à une concentration finale d’ADN plasmidique de ≥100 ng/μL.
3. Préparez 50 mL d’eau stérile ultrap....

Discussion

Même si cette procédure d’insertion chromosomique d’un système d’expression génique inductible à copie unique chez A. baumannii est techniquement simple et ne demande pas beaucoup de travail, il y a quelques étapes importantes qui doivent être soulignées. Tout d’abord, la préparation des cellules compétentes doit se faire autant que possible sur de la glace car les cellules deviennent fragiles lors du remplacement du milieu par de l’eau glacée. Idéalement, les étapes de centrifugation sont.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates