Techniques d’échantillonnage rapide de six organes cruciaux chez le xénope adulte

Résumé

Cet article présente un guide pour l’échantillonnage de six organes significatifs et diversifiés chez le xénope adulte qui peuvent être rapidement et facilement accessibles : le ventricule cardiaque, le lobe du foie, le pancréas, les corps adipeux, les reins appariés et la peau.

Résumé

Le xénope est un puissant organisme modèle pour comprendre le développement et la maladie des vertébrés depuis plus de cent ans. Bien que les techniques d’analyse expérimentale et de dissection de l’embryon aient été bien documentées, les descriptions des structures et des organes du xénope adulte, ainsi que les techniques de travail avec les adultes, n’ont pas été mises à jour pour tenir compte des exigences des approches modernes telles que la protéomique quantitative et la transcriptomique unicellulaire. Les perspectives centrées sur le type de cellule et le gène nécessitent des observations contrastées dans les stades embryonnaires par rapport à celles des tissus adultes. Les organes de la larve subissent des changements importants dans leur structure globale, leur morphologie et leur emplacement anatomique tout au long de la transition larvaire-adulte, notamment lors d’un remodelage massif de la métamorphose. Il est essentiel d’établir des normes solides pour l’identification et la dissection des organes afin de garantir la cohérence des ensembles de données résultant d’études réalisées dans différents laboratoires. Le présent protocole identifie six des organes du xénope adulte, démontrant des méthodes de dissection et d’échantillonnage du ventricule cardiaque, du foie, du corps adipeux, du pancréas, des reins appariés et de la peau du xénope adulte. Selon les méthodes de conservation, les organes disséqués peuvent être utilisés pour la protéomique quantitative, la transcriptomique unicellulaire/noyaux, l’hybridation in situ , l’immunohistochimie, l’histologie, etc. Ce protocole vise à normaliser l’échantillonnage des tissus et à faciliter les investigations multi-laboratoires des systèmes d’organes adultes.

Introduction

Bien que la « dissection numérique » du xénope adulte soit disponible¹, l’échantillonnage reproductible d’organes et de tissus du xénope adulte reste difficile sans les instructions détaillées disponibles pour d’autres modèles adultes (par exemple, souris^{2, 3, 4}). Cet article vise à fournir des conseils clairs pour un échantillonnage précis et reproductible d’organes de xénope adultes, similaire à ce qui est actuellement disponible pour leurs larves⁵. L’accent est mis sur la facilité de réalisation afin de conserver un maximum de fraîcheur et de rendre le protocole accessible à tous les utilisateurs.

Bien qu’il existe un guide de dissection complet pour Rana ^sp.6, ainsi que de nombreux guides de dissection en classe pour d’autres anoures⁷, aucun guide de dissection et d’échantillonnage de Xenopus n’est actuellement disponible. Pour ceux qui ne sont pas familiers avec les pratiques d’échantillonnage ou l’anatomie des amphibiens, les petites différences entre le xénope et les autres anoures rendent ces ressources sous-optimales pour l’échantillonnage de tissus reproductible.

De nombreux tissus précieux ne sont pas inclus et sont même jetés dans le présent guide ; Il s’agit d’assurer la fraîcheur des tissus. Six échantillons sont suffisamment limités pour garantir que ces tissus peuvent être prélevés en moins d’une heure après que le cœur commence à battre, quel que soit l’expérience ou le niveau de compétence de l’utilisateur. Des guides plus avancés et détaillés pour la collecte de nombreux autres tissus sont en cours de préparation en tant qu’articles d’accompagnement distincts.

Pour les utilisateurs moins expérimentés, il est toujours recommandé de tester d’abord ce protocole sur les animaux euthanasiés pour des raisons autres que l’expérimentation avant d’échantillonner les animaux difficiles à remplacer (c’est-à-dire les transgéniques, les animaux d’un âge avancé, etc.). Idéalement, tous les animaux échantillonnés seront en bonne santé et, s’ils sont femelles, n’auront pas été ovulés au cours des deux dernières semaines.

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Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux règles et règlements de l’IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) de la Harvard Medical School (IS 00001365_3). Les résultats représentatifs sont présentés pour un mâle albinos mature perfusé et non perfusé, Xenopus laevis.

1. Préparation expérimentale

REMARQUE : Si le protocole^de perfusion 8 est suivi avant l’échantillonnage, passez à l’étape 2.2.

1. S’assurer que l’établissement de recherche a approuvé la technique d’euthanasie décrite dans le présent protocole.
2. Préparez une solution de 5 g/L de MS-222 (méthanesulfonate de tricaïne) et de 5 g/L de bicarbonate de sodium (voir le tableau des matières). Le volume doit être supérieur au volume requis pour couvrir complètement les animaux euthanasiés. Vérifiez le pH pour vous assurer qu’il est ≥7.
3. Effectuer l’euthanasie primaire en plaçant le xénope dans la solution d’euthanasie ; L’animal restera immergé pendant un total de 1 h.
4. Installez la station de dissection de sorte qu’immédiatement après l’échantillonnage, tous les tissus puissent être rincés dans du PBS réfrigéré ou du PBS⁹ 0,7x (selon les besoins expérimentaux), vérifiés et coupés sous une lumière de grossissement de 5x (ou plus). Cette station doit également permettre à l’utilisateur de remplacer toutes les pinces et ciseaux ou de les essuyer entre les utilisations.
5. Une fois que la grenouille a été dans la solution pendant 1 h, l’euthanasie primaire a été terminée. Retirez la grenouille et vérifiez la perte de réponse à la douleur en effectuant un pincement du pied.
6. Consigner les détails appropriés pour l’animal, comme l’espèce, la souche, le sexe, l’âge et l’état de santé, ainsi que s’il a été perfusé. Pesez le xénope et prenez des mesures supplémentaires, telles que la longueur du museau et du cloaque.
7. Placez la grenouille sur son dos et épinglez les membres à proximité du corps (figure 1).
8. À l’aide de ciseaux de dissection, coupez à travers la peau, le long de la ligne médiane, puis latéralement, en faisant deux rabats.
9. En vous référant à la figure 2, identifiez la linea alba et utilisez des pinces pour la saisir et l’éloigner de la cavité cœlomique. Découpez soigneusement la musculature à l’aide de ciseaux. Faites deux rabats à partir de la paroi de la cavité. Coupez ou épinglez tous les rabats à l’écart.
10. Identifiez le cœur qui battra encore. Utilisez des ciseaux à disséquer pour réduire les os coracoïdes (Figure 2) afin de mieux accéder au cœur.
    REMARQUE : Si le cœur a cessé de battre avant l’échantillonnage, il convient de noter que la fraîcheur de l’échantillon a été compromise.

2. Échantillonnage

REMARQUE : Si l’animal a été perfusé, passez à l’étape 2.2.

1. Identifiez le péricarde mince et tirez-le avec une pince à tissus (Figure 3).
2. À l’aide de la pointe des ciseaux d’iridectomie, perforez doucement le péricarde en faisant attention de ne pas couper les tissus sous-jacents. Décollez le péricarde des 3 cavités du cœur.
3. À l’aide d’une pince, saisissez le ventricule par l’apex, identifiez l’endroit où il s’attache aux oreillettes et au tronc artériel (figure 4) et coupez-le sous ces attaches (figure 5). Si nécessaire, coupez le ventricule de manière à ce qu’aucun tissu des oreillettes ou du tronc artériel ne soit visible, et que le tissu valvulaire de couleur claire soit toujours visible à l’intérieur du ventricule.
   REMARQUE : Chez les animaux non perfusés, l’ablation du ventricule peut être considérée comme une euthanasie secondaire.
4. Les 3 lobes du foie seront visibles (Figure 6 et Figure 7). Saisissez la lèvre du lobe gauche (à droite de l’observateur) et soulevez-la doucement pour que les canaux hépatiques et kystiques soient visibles (Figure 8). Prélevez un échantillon du 1/3 inférieur du lobe sous ces accessoires (Figure 9).
5. Pour obtenir un meilleur accès aux tissus d’une grenouille femelle, il est utile d’enlever l’ovaire. Identifiez l’ovaire qui est enveloppé dans une couche de péritoine viscéral appelée épithélium germinal. Déplacez doucement les lobes jusqu’à ce qu’ils soient sur leurs côtés respectifs pour rendre la zone d’attache visible (Figure 10). Ces attaches sont directement ventrales au rein apparié.
6. À l’aide de ciseaux, retirez les ovaires le plus près possible des reins sans les endommager (Figure 11).
7. Inspectez le lobe médial (également appelé lobe antérieur) du foie et notez comment il se connecte à l’estomac et au duodénum par le mésentère et le canal hépatopancréatique (également appelé canal cholédoque) (Figure 6, Figure 7 et Figure 8).
8. Sectionnez le mésentère, le ligament hépatoduodénal à l’aide de ciseaux d’iridectomie ainsi que le canal hépatopancréatique où il rencontre le duodénum. Sectionner la connexion du pancréas et du canal hépatopancréatique au lobe médial du foie afin qu’aucun tissu hépatique foncé ne soit attaché (figure 12).
9. Saisissez l’estomac avec une pince dentée et l’extrémité supérieure du pancréas avec une pince à tissus. Sous un grossissement de 5x, taquinez doucement le pancréas de l’estomac (Figure 13).
   REMARQUE : S’il ne se détache pas proprement, le tissu pancréatique restant sera visible et pourra être prélevé en fragments. Alternativement, le pancréas peut être méthodiquement détaché à l’aide de ciseaux d’iridectomie et de pinces à tissus.
10. En vous référant à la figure 14A, identifiez la vessie et retirez-la en coupant le plus près possible du cloaque. Jetez ce tissu.
11. En vous référant à la figure 14B, identifiez le gros intestin et tirez-le pour sectionner le gros intestin aussi près que possible du cloaque. Retirez et jetez tout le tube digestif, en sectionnant le péritoine où il s’attache à la rate. Les corps adipeux seront désormais entièrement accessibles.
12. Séparez les corps gras de manière à ce qu’ils soient sur leurs côtés respectifs. La zone au-dessus du rein, où le corps adipeux se connecte au péritoine, sera visible. Saisissez la base du corps adipeux gauche (à droite du spectateur) et utilisez des ciseaux pour le couper du péritoine, en laissant une petite marge pour que le rein ne soit pas endommagé (Figure 15).
13. Retirez et jetez le reste du corps gras. Les reins appariés seront maintenant entièrement visibles.
14. Chez les grenouilles femelles ou les mâles avec des oviductes vestigiaux distincts, saisissez un oviducte et retirez-le du rein et du cloaque (figure 16). Coupez l’oviducte à l’endroit où il rencontre le cloaque et continuez à le retirer du rein, en coupant toutes les attaches péritonéales claires lorsqu’elles deviennent apparentes. Jetez ce tissu.
15. Répétez ce processus avec l’oviducte restant.
16. Les reins sont encore recouverts d’un péritoine clair (rétropéritonéal)¹⁰. Utilisez des pinces pour saisir les reins et sectionner le péritoine à leur extrémité inférieure.
17. Soulevez les reins hors de la cavité cœlomique à l’aide de ciseaux pour sectionner le péritoine le plus près possible des reins sans les endommager (Figure 17).
18. Sous un grossissement de 5x, coupez l’excès de péritoine et tout autre tissu restant (corps adipeux, rate). Si la grenouille est une femelle, assurez-vous d’enlever tout tissu ovarien restant (figure 18). Si la grenouille est un mâle, retirez soigneusement le testicule et vérifiez s’il y a un oviducte vestigial, qui peut ne pas être visible sans grossissement (figure 19).
19. Retirez les goupilles de l’animal, retournez-le sur son ventre et épinglez à nouveau les membres de l’animal.
20. Sélectionnez l’un ou l’autre des membres postérieurs à échantillonner et épinglez le pied de ce membre.
21. Retirez un lambeau de peau en forme d’amande sur le gastrocnémien/tibiopéroné (figure 20).

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Résultats

En utilisant les figures 1 à 20 et en suivant toutes les étapes de ce protocole, le ventricule cardiaque, le lobe gauche du foie, le pancréas, les corps adipeux gauches, les reins appariés et un lambeau de peau ont été proprement excisés dans l’heure qui a suivi l’euthanasie. Pendant ce temps, les échantillons sont rincés et parés de manière à ce qu’ils apparaissent, comme le montre la figure 21.

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Discussion

Comme ce protocole vise à maximiser la fraîcheur, certains échantillons peuvent inclure des tissus indésirables. Par exemple, le canal hépatopancréatique et une partie du mésentère sont échantillonnés avec le pancréas, et certains tissus péritonéaux, glandes surrénales et uretères seront toujours échantillonnés avec les reins appariés.  Si la fraîcheur n’est pas un problème, un échantillonnage plus précis peut être obtenu à l’aide de techniques modifiées.

L’appa...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
5x Magnifying Glass with LED Light and Stand	amazon.com	B08QJ6J8P1	light must not produce heat
Disposable Transfer Pipets	VWR	414004-036
Dissecting Fine-Pointed Forceps	Fisher Scinetific	08-875
Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5"	VWR	76457-374
Dissection Tray	Fisher Scinetific	14-370-284	styrofoam sheets are an acceptable alternative
Euthanasia container	US Plastic	Item 2860	alternative opaque containers acceptable
Euthanasia container lid	US Plastic	Item 3047
Iridectomy Scissors 6"	vwr	470018-938	iris scissors are an acceptable alternative
MS-222: Syncaine (formerly tricaine)	Pentair AES	TRS1
PBS 1x	Corning	21-040-CV
Sodium Bicarbonate, Powder, USP	Fisher Scientific	18-606-333
Specimen Forceps, Serrated	VWR	82027-442
T-Pins for Dissecting	Fisher Scinetific	S99385