Isolement nucléaire à partir de cellules sanguines dérivées in vitro cryoconservées

Résumé

Nous décrivons un protocole d’extraction de noyaux de haute qualité à partir de cellules souches pluripotentes induites cryopréservées, de types de cellules stromales/endothéliales et de cellules sanguines dérivées de cellules souches pluripotentes induites afin de soutenir les analyses de séquençage de nouvelle génération à noyau unique. La production de noyaux intacts de haute qualité est impérative pour les expériences multiomiques, mais peut constituer une barrière à l’entrée sur le terrain pour certains laboratoires.

Résumé

Les modèles basés sur les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont d’excellentes plateformes pour comprendre le développement du sang, et les cellules sanguines dérivées d’iPSC ont une utilité translationnelle en tant que réactifs d’essais cliniques et thérapies cellulaires transfusables. L’avènement et l’expansion de l’analyse multiomique, y compris, mais sans s’y limiter, le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNAseq) et le dosage de la chromatine accessible à la transposase (snATACseq), offre le potentiel de révolutionner notre compréhension du développement cellulaire. Cela inclut la biologie du développement à l’aide de modèles hématopoïétiques in vitro . Cependant, il peut être techniquement difficile d’isoler des noyaux intacts à partir de cellules cultivées ou primaires. Différents types de cellules nécessitent souvent des préparations nucléaires adaptées en fonction de la rigidité et du contenu cellulaires. Ces difficultés techniques peuvent limiter la qualité des données et constituer un obstacle pour les chercheurs intéressés à poursuivre des études multiomiques. La cryoconservation des échantillons est souvent nécessaire en raison des limites de la collecte et/ou du traitement des cellules, et les échantillons congelés peuvent présenter des défis techniques supplémentaires pour l’isolement nucléaire intact. Dans ce manuscrit, nous proposons une méthode détaillée pour isoler des noyaux de haute qualité à partir de cellules dérivées d’iPSC à différentes étapes du développement hématopoïétique in vitro pour une utilisation dans les flux de travail multiomiques à noyau unique. Nous avons axé le développement de la méthode sur l’isolement de noyaux à partir de cellules stromales/endothéliales adhérentes dérivées d’iPSC et de cellules progénitrices hématopoïétiques non adhérentes, car celles-ci représentent des types de cellules très différents en ce qui concerne l’identité structurelle et cellulaire. Les étapes de dépannage décrites ont limité l’agglutination et les débris nucléaires, ce qui a permis de récupérer des noyaux en quantité et en qualité suffisantes pour les analyses en aval. Des méthodes similaires peuvent être adaptées pour isoler des noyaux d’autres types de cellules cryoconservées.

Introduction

L’hématopoïèse est un système de développement relativement bien caractérisé, mais une incapacité à récapituler la formation des cellules sanguines in vitro démontre une compréhension incomplète des facteurs connexes. Les modèles d’hématopoïèse basés sur des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) peuvent aider à élucider les principaux facteurs de développement et la biologie associée. Le système iPSC offre également un excellent modèle pour étudier les troubles sanguins, et des cellules sanguines basées sur les iPSC ont été développées pour produire des réactifs pertinents sur le plan translationnel et thérapeutique 1,2,3,4. Les études sur cellules uniques ont été largement utilisées pour étudier la biologie du développement basée sur les iPSC, y compris les types de cellules produites pendant l’hématopoïèse⁵. Par rapport au séquençage de l’ARN en vrac, qui ne peut pas déduire les relations entre les sous-populations cellulaires⁶, les modalités unicellulaires permettent d’évaluer l’hétérogénéité cellulaire et peuvent faciliter l’identification et la caractérisation du développement cellulaire ^6,7.

La formation de cellules hématopoïétiques à partir d’iPSC nécessite une différenciation séquentielle par des états primitifs de strie, de mésoderme et d’endothélium pour former des cellules endothéliales hémogènes. Les cellules endothéliales hémogéniques sont des précurseurs directs des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques⁸. Ces types de cellules ont des propriétés morphologiques et cellulaires remarquablement différentes. Il existe une compréhension limitée du paysage épigénétique et de la dynamique du développement des modèles de cellules hématopoïétiques dérivées in vitro, bien qu’il s’agisse d’une connaissance essentielle pour libérer le plein potentiel thérapeutique du système iPSC. Dans de nombreux cas, seules les modalités d’analyse de cellules uniques permettent d’identifier les populations cellulaires, les activités transcriptionnelles, les paysages chromatiniens et les mécanismes de régulation qui régissent le développement parmi les préparations cellulaires hétérogènes.

Deux méthodologies, le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq) et le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNAseq), peuvent révéler des informations transcriptionnelles au niveau de la cellule individuelle⁹. L’un des principaux facteurs qui dictent la validité et la fiabilité des données est le besoin intransigeant d’échantillons répondant à des critères de qualité stricts. Il s’agit notamment d’exigences précises en matière de densité cellulaire/nucléaire, de viabilité optimale et d’agglutination minimale. La préparation de noyaux uniques peut être techniquement difficile. L’utilisation de cellules préalablement cryoconservées peut présenter des défis supplémentaires.

Nous notons quatre limites potentielles importantes aux approches standard de scRNAseq. Tout d’abord, les protocoles standard de génération de suspensions cellulaires font souvent référence à des préparations à partir de cellules ou de tissus frais, plutôt qu’à ceux récupérés après la cryoconservation¹⁰. Cela peut réduire l’utilité de ressources potentiellement précieuses. Deuxièmement, l’efficacité de dissociation de divers types de cellules est variable. Par exemple, de nombreux types de cellules immunitaires subissent une dissociation avec une relative facilité. En revanche, les cellules stromales, les fibroblastes et les cellules endothéliales, qui sont normalement intégrés dans la matrice extracellulaire et la membrane basale, ont des propriétés cellulaires uniques qui peuvent compliquer l’isolement des noyaux^11,12. Ces propriétés peuvent nécessiter des protocoles de dissociation agressifs, ce qui peut compromettre l’intégrité structurelle de populations cellulaires plus délicates. Troisièmement, certaines cellules (p. ex. les mégacaryocytes) peuvent dépasser 100 m de diamètre et poser des difficultés à plusieurs plateformes commerciales existantes de cellules uniques¹³. De plus, une mauvaise manipulation peut entraîner des dommages cellulaires et des réponses de stress au cours des premières étapes de l’isolement cellulaire, impliquant l’hydrolyse enzymatique et la dissociation mécanique, ce qui peut avoir un impact sur les profils d’expression génique^11,14.

Pour ces raisons et d’autres, l’approche à noyau unique peut être une solution de rechange préférable aux méthodes à cellule unique¹⁵. Étant donné la stabilité supérieure de la membrane nucléaire par rapport à la membrane cellulaire, l’enveloppe nucléaire peut rester intacte même après la cryoconservation des tissus¹⁶. Cela peut faciliter l’extraction nucléaire et améliorer la diversité des types d’échantillons adaptés aux modalités de séquençage de nouvelle génération. Deuxièmement, les noyaux présentent une résistance accrue aux perturbations mécaniques et ont tendance à manifester moins de changements transcriptionnels lors de la dissociation¹⁴. Par conséquent, les noyaux peuvent fournir une plus grande stabilité de l’ARN et des profils transcriptionnels plus reproductibles. Un troisième avantage notable des méthodes à noyau unique est l’absence de contraintes de taille cellulaire et l’applicabilité pour des cellules plus grandes, comme les cardiomyocytes ou les mégacaryocytes¹². Quatrièmement, les noyaux servent de substrats appropriés pour les analyses multiomiques, qui offrent des informations élargies à partir de l’analyse intégrée de l’expression des gènes, des régions de chromatine accessibles et d’autres paramètres¹⁷, permettant une compréhension plus approfondie de l’hétérogénéité, du développement et des états fonctionnels^{des cellules 18}.

En profilant les iPSC au cours du développement hématopoïétique, les approches multiomiques peuvent aider à définir les processus de développement dans des modèles de maladies normales ou pathologiques. Les comparaisons de cellules dérivées d’iPSC avec des cellules ou des tissus primaires peuvent également fournir une évaluation de la fidélité du modèle iPSC à la biologie in vivo , facilitant ainsi l’amélioration du modèle iPSC et la découverte de nouvelles populations cellulaires et de facteurs favorisant la formation du sang.

Bien que de nombreux groupes aient réussi à naviguer dans l’isolement nucléaire et l’analyse de séquençage de nouvelle génération qui en résulte, l’isolement de noyaux de haute qualité reste un obstacle pour certains laboratoires intéressés à effectuer des analyses basées sur un seul noyau. Ce manuscrit détaille un protocole permettant d’isoler des noyaux de qualité à partir de cellules dérivées d’iPSC précédemment cryoconservées. Nous nous sommes concentrés sur les cellules stromales/endothéliales adhérentes et les cellules progénitrices hématopoïétiques non adhérentes, car elles représentent des types de cellules très différents en termes de structure et de contenu qui nécessitent des modifications et un dépannage adaptés pour améliorer la récupération de noyaux de haute qualité se prêtant au séquençage de prochaine génération ou à d’autres expériences.

Protocole

1. Cryoconservation des cellules

1. Congeler >1 x 10⁶ cellules isolées dérivées d’iPSC par mL dans 1 mL de 90 % de FBS et de 10 % de DMSO. Placez les cryoflacons dans un récipient de congélation à -80°C pour réduire la vitesse de congélation et optimiser la récupération des cellules viables (Tableau des matériaux). Anticipez une perte cellulaire considérable, qui peut varier en fonction des conditions de culture et de l’identité cellulaire.
2. Passez de -80 °C à un stockage d’azote liquide dans les 24 h.

2. Décongélation des cellules

1. Récupérer le cryoflacon de l’entrepôt d’azote liquide et le décongeler dans un bain-marie à 37 °C pendant 2 min. Retirer du bain-marie pendant que de petits cristaux de glace sont encore visibles.
2. Transférez les cellules du cryoflacon dans un tube vide de 15 ml et ajoutez lentement 10 ml de milieu préchauffé (RPMI 1640 + 10 % FBS) tout en mélangeant soigneusement. Centrifugeuse à 400 x g pendant 3 min à 25 °C.
3. Aspirer le surnageant et le reconstituer dans 1 mL de DPBS complété par 2 % de FBS et 1 mM de CaCl₂ (Table des matières). Mélangez soigneusement en pipetant 3x avec une micropipette de 1000 μL. Transférer dans un tube à fond rond en polystyrène de 5 ml.

3. Élimination des cellules mortes

1. Ajouter 50 μL de cocktail d’élimination des cellules mortes (Table des matériaux) à 1 mL de suspension cellulaire. Ajouter 50 μL de cocktail de sélection de biotine au mélange de cellules. Incuber à température ambiante pendant 3 min. Ces étapes permettent d’étiqueter les cellules mortes Annexine V⁺ contenues dans la suspension cellulaire avec de la biotine.
2. Tourbillonnant vigoureusement pendant 30 s, les billes de dextran conçues pour l’épuisement des types de cellules indésirables étiquetées à la biotine (Table des matériaux). Ajoutez 100 μL de billes de dextran à la suspension cellulaire et mélangez en pipetant doucement de haut en bas 2x avec une micropipette de 1000 μL (Table des matériaux).
3. Ajouter 1,3 mL de DPBS contenant 2 % de FBS et 1 mM de CaCl₂ à la suspension cellulaire et mélanger en pipetant doucement de haut en bas 2 fois avec une micropipette de 1000 μL. Placez le tube dans l’aimant (Table des matériaux) et incubez à température ambiante pendant 3 min.
4. Retournez l’aimant et le tube pour verser la suspension de cellules vivantes enrichie dans un nouveau tube conique de 15 ml. Centrifugeuse à 400 x g pendant 3 min à 4°C. Retirer la majeure partie du surnageant et remettre en suspension dans 1 mL de DPBS + 0,04 % de BSA. Mélangez délicatement en pipetant 3 fois avec une micropipette de 1000 μL.

4. Isolement des noyaux

1. Centrifuger la suspension de cellules vivantes à 460 x g pendant 5 min à 4 °C, puis aspirer le surnageant, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de rupture de la pastille de cellule.
2. Ajouter 100 μL de tampon de lyse 0,5x fraîchement préparé et refroidi sur de la glace (Tableau 1) et mélanger délicatement en pipetant 10x avec une micropipette de 100 μL. Incuber 3 min sur glace.
3. Ajouter 500 μL de tampon de lavage réfrigéré (tableau 2) dans le tube sans mélanger. Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.

5. Lavage et évaluation des noyaux

1. Aspirer le surnageant et ajouter 500 μL de tampon de lavage réfrigéré pour dissoudre le reste intact des granulés sans mélanger. Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 °C. Éliminer tout surnageant sans perturber les noyaux cuiller.
2. Mettre en suspension dans 120 μL de tampon de noyaux dilués réfrigérés (tableau 3). Filtrez la suspension cellulaire à l’aide d’une crépine de cellule de 40 μm (table des matériaux).
3. Colorer avec 0,4 % de bleu de trypan et évaluer visuellement la qualité des noyaux isolés sous un microscope 10x (Table des matériaux).

6. Traitement des noyaux isolés

1. Gardez les noyaux sur la glace. Passez immédiatement au traitement ultérieur, car l’agglutination nucléaire peut se produire au fil du temps et nécessiter des étapes de filtration supplémentaires.

Résultats

Nous avons utilisé le protocole susmentionné pour extraire des noyaux de cellules stromales/endothéliales adhérentes dérivées d’iPSC cryopréservées et de cellules progénitrices hématopoïétiques non adhérentes (flottantes). Une représentation schématique détaillée de la procédure d’isolement nucléaire se trouve à la figure 1.

Pour l’examen morphologique, des noyaux isolés ont été colorés au bleu trypan et visualisés au microscope. L?...

Discussion

Étapes critiques du protocole
L’isolement de noyaux de haute qualité est essentiel pour la mise en œuvre réussie des modalités actuelles de séquençage de nouvelle génération basées sur un noyau unique, qui évoluent rapidement. Compte tenu des obstacles existants pour les laboratoires intéressés par ces approches, en particulier pour les échantillons cryoconservés, notre intention était de mettre au point une technique d’isolement nucléaire adaptée aux cellules préalablement cong...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture Reagents
Dimethyl sulfoxide solution (DMSO)	Sigma	673439
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Corning	21031CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	GeminiBio	100106
RPMI Medium 1640 (1X)	Gibco	11875093
Cells
Induced pluripotent stem cells	N/A	N/A	The iPSCs used in this study were obtained through the CHOP Human Pluripotent Stem Cell Core Facility
Cell Staining Reagents
Trypan Blue Solution	Corning	25900CI
Dead Cell Removal Reagents
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma	C4901
EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	StemCell Technologies	17899	This kit is designed for the depletion of unwanted cell types labeled with biotin. The kit includes Dead Cell Removal (Annexin V) Cocktail, Biotin Selection Cocktail, and Dextran beads. This kit targets phosphatidylserine on the outer leaflet of the cell membrane of apoptotic cells using Annexin V. Unwanted cells are labeled with Annexin V, Biotinylated antibodies, and magnetic particles, and separated without columns using an EasySep magnet. Desired cells are simply poured off into a new tube.
Materials
10 µl Micropipette	Wards science	470231606
100 µl Micropipette	Wards science	470231598
1000 µl Extended Universal Tip	Oxford Lab Products	OAR-1000XL-SLF
1000 µl Micropipette	Wards science	470231602
2.0 ml Cryogenic vials	Corning	431386
20 µl Micropipette	Wards science	470231608
200 µl Micropipette	Wards science	470231600
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube	Falcon	352063
Corning DeckWork 0.1-10 µl Pipet Tip Station	Corning	4143
Corning DeckWork 1-200 µl Pipet Tip Station	Corning	4144
Counting chamber	CytoSMART	699910591
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
Magnet	StemCell Technologies	18000
NALGENE Cryo 1°C Freezing Container	Nalgene	51000001
Nuclei Isolation Reagents			Nuclei isolation reagents include Lysis Buffer,  Wash buffer, and Diluted Nuclei Buffer,and Lysis Dilution Buffer. The constitution of these buffers are in the Table 1, 2, and 3. Our nuclei isolation method improved isolation from the standard kit protocols (e.g., 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). This protocol can be used with several commercial kits, including the Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283).
Dead Cell Removal kit	STEMCELL	17899
Digitonin	Thermo Fisher Scientific	BN2006
DL-Dithiothreitol solution (DTT)	Sigma	646563
Flowmi Cell Strainer, 40 µm	Bel-Art	H136800040
MACS bovine serum albumin (BSA) stock Solution	Miltenyi Biotec	130091376
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma	7786303
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma	M1028
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385
Nuclease-Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937
Nuclei Buffer (20X)	10X Genomics	2000153
Protector RNase inhibitor	Sigma	3335399001
Sodium chloride (NaCl)	Sigma	S7653-250G
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma	59222C
Trizma Hydrochloride Soultion, pH 7.4	Sigma	T2194
Trizma hydrochloride (Tris-HCl) (pH7.4)	Sigma	T3252-500G
Tween 20	Bio-Rad	1662404
Other equipment
Automated cell counter	CytoSMART	699910591
Microscope	Zeiss	Primostar 3