Synthèse et dosage d’inhibiteurs de détection du quorum de Vibrio

Résumé

Les composés thiophénésulfonamides sont des inhibiteurs puissants et spécifiques des régulateurs de détection du quorum Vibrio LuxR/HapR qui bloquent leur activité in vivo, empêchant ainsi la transcription des gènes de virulence, de motilité et de biofilms. Ce protocole détaille comment ces composés sont synthétisés, modélisés in silico et testés in vivo pour leur activité contre LuxR/HapR.

Résumé

Les bactéries détectent les nombres de population locale à l’aide de la détection de quorum, une méthode de communication entre cellules largement utilisée pour contrôler les comportements bactériens. Chez les espèces de Vibrio , les régulateurs de détection de quorum maîtres LuxR/HapR contrôlent des centaines de gènes de détection de quorum, dont beaucoup influencent la virulence, le métabolisme, la motilité, etc. Les thiophénésulfamides sont de puissants inhibiteurs de LuxR/HapR qui lient la poche de ligand dans ces facteurs de transcription et bloquent l’expression des gènes de détection du quorum en aval. Cette classe de composés a servi de base au développement d’un ensemble de procédures simples, robustes et éducatives permettant aux étudiants d’assimiler leurs compétences en chimie et en biologie à l’aide d’un modèle CURE : expérience de recherche de premier cycle basée sur un cours. Des protocoles optimisés sont décrits qui comprennent trois étapes d’apprentissage dans une plateforme itérative et multidisciplinaire pour engager les étudiants dans une cure d’un an : (1) concevoir et synthétiser de nouveaux inhibiteurs de petites molécules basés sur le noyau de thiophènesulfonamide, (2) utiliser la modélisation structurelle pour prédire l’affinité de liaison à la cible, et (3) tester l’efficacité des composés dans des tests microbiologiques contre des protéines spécifiques de Vibrio LuxR/HapR. Le test rapporteur décrit effectué chez E. coli permet de prédire avec succès l’efficacité des composés contre les protéines cibles de l’espèce indigène Vibrio .

Introduction

Les bactéries détectent la densité de la population et le type de cellules à proximité à l’aide d’un processus de communication cellule-cellule appelé détection de quorum (QS)¹. Divers clades de bactéries utilisent le QS pour contrôler divers comportements, tels que la motilité, la formation de biofilms, la sécrétion de facteur de virulence, etc. Les protéines et les signaux impliqués dans le QS diffèrent considérablement d’une bactérie à l’autre. Chez les espèces de Vibrio , le système de signalisation QS utilise principalement des récepteurs hybrides histidine-kinase liés à la membrane qui reconnaissent des signaux spécifiques de petites molécules apparentées appelées auto-inducteurs² (Figure 1). Ces récepteurs contrôlent le flux de phosphate à travers le système vers un régulateur de réponse qui transcrit de petits ARN. La production d’ARNs modifie la production du régulateur de détection du quorum maître, qui est défini comme un groupe conservé de protéines collectivement appelé LuxR/HapR³. Ainsi, à de faibles densités cellulaires, l’ARNm codant pour LuxR/HapR est dégradé par le ciblage de l’ARNs, et à haute densité cellulaire, la protéine LuxR/HapR est produite à des niveaux maximaux (examiné dans Ball et ^al.3).

Le groupe de protéines LuxR/HapR appartient au grand groupe de protéines TetR, qui est défini par la présence d’une hélice-tour-hélice dans le domaine de liaison à l’ADN, la formation d’un homodimère fonctionnel et généralement l’inclusion d’un domaine de liaison de ligand⁴. Les protéines Vibrio LuxR/HapR répondent à tous ces critères, bien qu’aucun ligand n’ait encore été identifié. La protéine LuxR/HapR chez toutes les espèces de Vibrio étudiées contrôle de nombreux comportements en aval, dont beaucoup sont connus pour être importants dans la pathogenèse : production de biofilms, de protéases, de cytotoxines, d’hémolysines, de sécrétion de type III et de complexes de sécrétion de type VI,^{et plus} encore3. La délétion de la protéine LuxR/HapR entraîne une diminution ou une perte de virulence dans les systèmes hôtes ^5,6,7, ce qui conduit à l’hypothèse que l’inhibition de ces protéines est une stratégie viable pour contrer la progression de la maladie. Les espèces de vibrio provoquent la vibriose chez les organismes marins, notamment les poissons, les crustacés et les coraux, ainsi que chez les humains qui entrent en contact ou ingèrent certaines espèces.

Des recherches antérieures ont identifié un panel de composés thiophènesulfonamide qui se lient spécifiquement au domaine de liaison au ligand des protéines LuxR/HapR chez plusieurs espèces de Vibrio pour bloquer leur fonction ^5,8,9 (Figure 1). À l’aide d’un criblage rapporteur chez E. coli, les composés ont été identifiés et ensuite testés dans le Vibrio natif, qui a montré une forte corrélation entre l’effet chez l’E. coli hétérologue et l’efficacité dans le Vibrio⁹. Ces composés sont simples à synthétiser en une seule étape, ce qui les rend idéaux pour la synthèse de petites bibliothèques dans le cadre d’un cours de laboratoire de biologie chimique. Une expérience de recherche de premier cycle (CURE) de trois semaines qui a été conçue autour de cet échafaudage moléculaire a déjà été signalée⁸. Ce module de trois semaines a été optimisé, rationalisé et élargi dans le cadre de cette étude CURE d’un an conçue pour cibler l’inhibition des protéines LuxR/HapR chez diverses espèces de Vibrio.

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé pour l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Conception et synthèse de banques de thiophènesulfonamides

REMARQUE : Les inhibiteurs du thiophènesulfonamide tels que le 3-phényl-1-(thiophène-2-ylsulfonyl)-1 H-pyrazole (PTSP) sont synthétisés par condensation de base en une étape ^8,9, comme le montre la figure 2. Pour concevoir de nouvelles bibliothèques de composés à étudier, les chercheurs doivent se procurer des amines et des chlorures de sulfonyle appropriés et suivre les étapes résumées ci-dessous. Si la structure de l’amine diffère considérablement de celle du dérivé aromatique du pyrazole, il peut être nécessaire d’identifier d’autres conditions de réaction en effectuant une recherche dans la littérature. Cette procédure est robuste, et des bases telles que l’hydroxyde de sodium, la triéthylamine et la pyridine ont également bien fonctionné. Si cela est effectué dans un cours, les étudiants peuvent avoir la liberté de choisir leur propre procédure avec des résultats probablement favorables.

1. Synthèse et isolement du PTSP
   REMARQUE : Cela peut être complété en une période de laboratoire de 3 heures.
   1. Dissoudre 822 mg de phénylpyrazole (5,7 mmol de l’amine, 1,5 eq.) dans 15 mL de tétrahydrofurane dans une fiole à fond rond de 50 mL à l’aide d’un agitateur.
   2. Ajouter lentement 306 mg d’hydrure de sodium (60 % dans l’huile, 7,65 mmol, 2 eq.) pour créer une suspension. Laissez cette suspension remuer sur une plaque d’agitation pendant 10 min.
   3. Dans un flacon, préparer une solution de chlorure de thiophènesulfonyle (3,82 mmol de chlorure de sulfonyle, 1 eq.) dans 5 mL de THF.
   4. Ajouter la solution de chlorure de sulfonyle préparée à l’étape 1.1.3 à la suspension préparée à l’étape 1.1.2 et laisser la suspension résultante agiter pendant 30 minutes supplémentaires.
   5. Ajouter 20 mL d’eau DI au mélange réactionnel dans la fiole à fond rond de 50 mL.
   6. Transvaser tout le contenu du ballon de réaction, à l’exception de la barre d’agitation, dans un entonnoir séparateur¹⁰ de 250 ml.
   7. Ajouter 20 ml d’acétate d’éthyle (EtOAc) dans l’entonnoir séparateur et agiter.
   8. Retirez la couche inférieure (aqueuse) et réservez.
   9. Retirer la couche supérieure (organique) et réserver dans un erlenmeyer de 200 ml.
   10. Remettre la couche aqueuse dans l’entonnoir de séparation et extraire avec 20 mL d’acétate d’éthyle.
   11. Répétez les étapes 1.1.8 et 1.1.9.
   12. Remettre les couches organiques combinées dans l’entonnoir de séparation et laver avec 20 ml de NaCl saturé (saumure).
   13. Retirez la couche inférieure (aqueuse) et réservez.
   14. Égouttez la couche supérieure (organique) dans l’erlenmeyer.
   15. Sécher les couches organiques combinées sur du MgSO₄ dans l’erlenmeyer et filtrer dans une fiole à fond rond de 250 mL à l’aide de papier filtre qualitatif¹⁰.
   16. Retirez le solvant organique sur un évaporateur rotatif.
2. Analyser le mélange réactionnel brut par RMN ¹H pour s’assurer que le produit a formé¹⁰.
   REMARQUE : Le temps nécessaire à cette étape dépendra du niveau d’aisance de l’élève avec la spectroscopie RMN.
3. Purifier le produit par chromatographie sur colonne de gel de silice (hexanes 10:1 : acétate d’éthyle)¹⁰.
   REMARQUE : Cela peut être complété en une période de laboratoire de 3 heures.
4. Caractériser le produit de manière spectroscopique.
   REMARQUE : Le temps nécessaire à cette étape dépendra du niveau d’aisance de l’élève avec la spectroscopie RMN.
   REMARQUE : Données de caractérisation du 3-phényl-1-(thiophène-2-ylsulfonyl)-1 H-pyrazole (PTSP)¹⁰ :
   ¹RMN H (400 MHz, CDCl ₃ ) : δ 8,11 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 7,88 - 7,79 (m, 3H), 7,68 (dd, J = 5,0, 1,4 Hz, 1H), 7,44 - 7,31 (m, 3H), 7,07 (dd, J = 5,0, 3,9 Hz, 1H), 6,71 (d, J = 2,8 Hz, 1H).
   ^{RMN 13}C (101 MHz, CDCl ₃ ) : δ 157.17, 136.84, 135.40, 135.36, 132.55, 131.28, 129.36, 128.72, 127.79, 126.47, 106.90.
   SGRH (ESI) : Calculé pour C₁₃H₁₀O₂N₂NaS₂ [M+Na⁺] : 313,0076. Trouvé : 313.0078.

2. Modélisation structurale pour prédire la liaison des thiophènesulfamides au régulateur Vibrio LuxR/HapR

REMARQUE : Ce protocole utilise la version Web d’AutoDock Vina appelée Webina¹¹ pour ancrer des inhibiteurs de petites molécules (PTSP dans ce cas) dans la poche de liaison du ligand de l’homologue LuxR/HapR appelé SmcR de Vibrio vulnificus¹². Les résultats de ce protocole sont (1) des affinités de liaison calculées et (2) un fichier de structure qui peut être ouvert dans PyMol ou un programme connexe pour visualiser les interactions ligand-protéine. Ce protocole peut être adapté à n’importe quelle petite molécule et à toute protéine avec une poche de liaison de ligand. Il faut quelques minutes pour s’amarrer à SmcR car la zone de recherche de ce récepteur est définie ci-dessous. S’il faut définir la zone de recherche d’un nouveau récepteur (étapes 2.15 à 2.20), cela peut être fait en une période de laboratoire de 3 heures. Une fois la zone de recherche définie, les amarrages suivants ne prendront que quelques minutes.

1. Téléchargez les outils AutoDock. Sélectionnez le fichier approprié pour le système d’exploitation et installez-le sur l’ordinateur.
   REMARQUE : Ce protocole utilise une version Web d’AutoDock Vina. L’amarrage peut également être effectué localement si ce programme est installé (voir les instructions du fabricant).
2. Téléchargez la structure pour apo SmcR.
3. Accédez à la banque de données sur les protéines.
4. Dans la barre de recherche, entrez l’ID PDB 3KZ9.
5. Cliquez sur Télécharger les fichiers dans le menu déroulant vers le coin supérieur droit de la page et sélectionnez le format pdb .
6. Après avoir téléchargé le fichier , enregistrez-le dans un nouveau dossier dédié au travail d’amarrage.
7. Créez un fichier de structure .mol de l’inhibiteur de petites molécules (PTSP).
8. Naviguez jusqu’à molview et cliquez sur l’icône de la corbeille pour supprimer la structure qui s’y trouve.
9. Dessinez PTSP dans la fenêtre de la structure.
10. Cliquez sur 2D vers 3D.
11. Cliquez sur Outils → exporter → fichier MOL.
12. Un fichier intitulé « Molview.mol » sera téléchargé sur l’ordinateur. Donnez au fichier un nom qui a du sens et enregistrez-le dans le dossier qui contient le fichier pdb de la protéine.
13. Définissez la zone de recherche.
14. Définissez l’aire dans Webina comme la poche de liaison de la protéine (SmcR) pour faciliter l’amarrage dans la bonne région.
    REMARQUE : Les coordonnées de SmcR sont fournies et générées à l’aide du protocole suivant. Si SmcR est utilisé, les étapes 2.15 à 2.20 peuvent être ignorées. Le protocole peut être adapté à n’importe quelle protéine avec une poche de liaison de ligand connue. Coordonnées : center_x = 17, center_y = 40, center_z = 56, size_x = 12, size_y = 12, size_z = 12.
15. Dans les outils AutoDock, cliquez sur Fichier → Lire la molécule et ouvrez le fichier de protéine pdb téléchargé à l’étape 2.5.
16. Accédez au tableau de bord et cliquez sur la flèche bleue à côté du nom de la protéine. Cela fera apparaître une liste de chaînes. Cliquez sur la flèche bleue à côté de l’une des chaînes de protéines.
17. Pour mettre en évidence les acides aminés de la poche de liaison, trouvez l’acide aminé d’intérêt dans la liste qui est apparue. À côté de l’acide aminé, allez dans le triangle dans la colonne Cl (couleur) à l’extrême droite. Cliquez sur le triangle et sélectionnez par arc-en-ciel.
    REMARQUE : Utilisez cette méthode pour mettre en évidence les acides aminés suivants :¹² Phe75, Phe78, Leu79, Ile96, Met100, Trp114, Phe129, Asn133, Gln137, Val140, Ala163, Phe166, His167, Cys170 (si Met100 est manquant, cela peut être ignoré).
18. Ensuite, cliquez sur Grid → GridBox. Une boîte doit apparaître sur la structure de la protéine avec une face rouge, verte et bleue. Avant d’apporter des modifications, remplacez l’espacement (angström) par 1. Cela garantira que la boîte est correctement mise à l’échelle pour les prochaines étapes.
    1. Ensuite, modifiez les cadrans de la boîte de grille centrale pour traduire la boîte dans les directions x, y et z afin de la placer sur les acides aminés en surbrillance. Cliquez et faites glisser sur la protéine pour faire pivoter la structure en trois dimensions.
       REMARQUE : Cela aidera à s’assurer que la boîte est dans la bonne position. Si nécessaire, utilisez les trois cadrans supérieurs pour le nombre de points afin de modifier la taille de la boîte.
19. Une fois la position et les dimensions de la boîte définies, cliquez sur Fichier → Fermer Enregistrement du courant.
20. Dans le menu, cliquez sur Grille → Sortie → Enregistrer GPF. Nommez le fichier et enregistrez-le dans le même dossier que les deux fichiers de structure. Ce fichier GPF contient les coordonnées de la boîte.
21. Effectuez le « Docking » dans Webina pour générer une énergie de liaison calculée.
22. Ouvrez le dossier qui contient le fichier de ligand .mol et le fichier de protéine .pdb. Webina nécessite des fichiers .pdbqt et effectuera la conversion des fichiers.
23. Accédez à Webina.
24. Récepteur : Faites glisser le curseur sur le fichier téléchargé à partir de la base de données appelée 3kz9.pdb. Cliquez sur Ajouter des atomes d’hydrogène, puis cliquez sur convertir. Cliquez sur Ok dans la fenêtre contextuelle suivante pour travailler avec un monomère.
25. Ligand : faites glisser le curseur sur le fichier .mol pour PTSP (ou un autre inhibiteur de petites molécules). Assurez-vous qu’aucune case n’est sélectionnée et cliquez sur Convertir. Laissez l’option « Corriger la pose » vide et faites défiler jusqu’à la boîte d’accueil. Entrez les paramètres de boîte appropriés (soit ceux énumérés ci-dessus pour SmcR, soit un ensemble généré par le protocole aux étapes 2.15-2.20 pour une protéine différente).
26. Cliquez sur Démarrer Webina et attendez.
27. Une série d’énergies de liaison calculées sera rapportée [Affinité (kcal/mol)] directement sous une visualisation de la molécule amarrée. Assurez-vous que la première valeur est la plus négative.
28. Pour visualiser le ligand ancré dans pymol ou un autre programme similaire, téléchargez le fichier PDBQT de sortie en cliquant sur le bouton de téléchargement approprié. Ce fichier n’est que le ligand (PTSP) dans les coordonnées ancrées.
29. Visualisez le complexe ligand-SmcR arrimé dans PyMol¹³.
    1. Téléchargez et ouvrez PyMol.
       REMARQUE : Les étudiants à temps plein et les éducateurs peuvent recevoir une licence PyMol gratuitement. Lorsqu’on vous demande une licence après avoir démarré PyMol pour la première fois, cliquez sur Acheter une licence. Sélectionnez Élève/Enseignant.
    2. Ouvrez le fichier pdb appelé 3kz9.pdb.
    3. Ouvrez le fichier de sortie pdbqt créé par Webina.
    4. Visualisez la meilleure conformation (celle avec l’affinité de liaison la plus faible) en cliquant sur les petites flèches pointantes en bas à droite de l’écran PyMol. La première conformation sera la plus favorable et se verra à l’ouverture du fichier.
    5. Manipulez la protéine avec le ligand amarré dans PyMol à l’aide des commandes standard¹⁴.
       REMARQUE : L’étude précédente de Newman et al. a comparé les affinités de liaison prédites de plusieurs composés déterminées par Webina à des essais in vitro et in vivo ⁹. Ces affinités de liaison servent de références pour les composés susceptibles d’être de bons inhibiteurs avec des affinités élevées (qui sont corrélées à des nombres kcal/mol plus faibles) pour la poche de liaison. Un exemple des données de sortie Webina est inclus dans la figure 3A,B pour la liaison PTSP dans la poche de SmcR.

3. Évaluation biologique des thiophénésulfamides dans l’inhibition de la détection du quorum

REMARQUE : La procédure spécifique pour le dosage de la protéine LuxR de Vibrio campbellii est décrite ici. Cependant, cette procédure peut être adaptée pour être utilisée avec n’importe quelle protéine Vibrio LuxR/HapR, qui sont toutes disponibles sur des plasmides à réplication ectopique compatibles avec le plasmide rapporteur pJV064⁹. Le test « écran rouge-vert » est réalisé dans un fond bactérien hétérologue à l’aide de cellules E. coli contenant les deux plasmides. Le plasmide d’expression LuxR/HapR (conférant une résistance à la kanamycine) est disponible et exprime différents gènes LuxR (Figure 4A). Le plasmide pJV064 (conférant une résistance au chloramphénicol) code pour un gène gfp sous le contrôle d’un promoteur activé par LuxR et un gène mCherry sous le contrôle d’un promoteur réprimé par LuxR (Figure 4A). Les deux promoteurs ont été choisis en raison de leur identification en tant que gènes régulés par LuxR avec de grands changements d’expression in vivo¹⁵. Les souches d’E. coli LuxR/HapR et le plasmide pJV064 ont été publiés précédemment ^9,15.

1. Préparation des milieux liquides : Préparez 1 L de milieu LB.
   1. Pesez 10 g de NaCl, 10 g de bactotryptone et 5 g d’extrait de levure.
   2. Mélangez les composants dans un bécher ou un cylindre gradué à l’aide d’une plaque d’agitation.
   3. Porter le volume total à 1 L à l’aide de cylindres gradués.
   4. Si désiré, aliquote dans 100 mL par bouteille avant l’autoclavage.
   5. Autoclave pendant 15 min pour chaque 1 L de support. Alternativement, si un autoclave n’est pas disponible, un Instant Pot peut être utilisé¹⁶.
2. Inoculation de la souche (Jour 1)
   1. Ajouter des antibiotiques au milieu LB aux concentrations finales de kanamycine (40 μg/mL) et de chloramphénicol (10 μg/mL).
   2. Aliquote 5 mL de milieu LB/Kan40/CM10 dans des tubes à essai stériles avec bouchons.
   3. Inoculer des souches d’E. coli à partir de stocks congelés : culture d’E. coli exprimant LuxR/HapR et le plasmide pJV064 (LuxR+)^9,15 ; Culture de lutte antivectorielle vide E. coli et plasmide pJV064 (LuxR-)^9,15.
   4. Agiter la culture pendant une nuit à 275 tr/min à 30 °C pendant 16-18 h.
3. Dosage des thiophènesulfamides (jour 2)
   1. Pesez ~30 mg du composé. Remettre en suspension à 100 mM dans le DMSO et le vortex pour mélanger. Ensuite, préparez un stock de 10 mM.
   2. Mélangez 20 μL de la pâte de 100 mM avec 180 μL de DMSO pour le diluer (1:10) afin d’obtenir une matière de travail de 10 mM. Vortex à mélanger.
   3. Diluer à contre-courant la culture LuxR+ et les cultures LuxR- (1:100) dans 10 mL de milieu LB/Kan/CM dans des tubes coniques de 15 mL et agiter brièvement pour mélanger.
   4. Utilisez une plaque stérile à 96 puits à fond noir, à fond transparent pour le dosage.
   5. Préparez une série de dilutions pour toutes les colonnes. Un schéma de la série de dilution 4 fois est inclus à titre de référence (figure 4B).
      REMARQUE : Une pipette numérique multicanaux est recommandée pour ce processus. Cette méthode permet d’obtenir une série de dilution 4 fois (1:4). Cependant, différentes séries de dilution peuvent être utilisées (par exemple, 1:10, 1:5).
      1. Pipeter 200 μL du mélange de culture LuxR+ dans une plaque à 96 puits dans la rangée A, 1 à 6 (figure 4B ; vert).
      2. Pipeter 200 μL du mélange de culture LuxR dans une plaque de 96 puits dans la rangée A, 7-12 (figure 4B ; orange).
      3. Pipeter 150 μL du mélange de culture LuxR+ dans une plaque de 96 puits en rangées B-E, 1-6 (figure 4B ; vert).
      4. Pipeter 150 μL du mélange de culture LuxR dans une plaque de 96 puits en rangées B-E, 7-12 (figure 4B ; orange).
      5. Ajouter 2 μL du composé ou du DMSO dans chaque puits de la rangée A conformément à la figure 4B.
      6. Pour chaque colonne, effectuez une pipette vers le haut et vers le bas 3 fois, puis transférez 50 μL de la rangée A à la rangée B, dans la même colonne.
      7. Répétez le mélange et le pipetage pour les rangées B, C, D, E. Après avoir mélangé la rangée E, prélever 50 μL et mettre les déchets. Au final, il faut avoir 150 μL dans chaque puits.
   6. Couvrez la plaque avec du ruban adhésif microporeux.
   7. Incuber la plaque en l’agitant à 275 tr/min à 30 °C pendant une nuit de 16 à 18 h.
   8. Mesurer la fluorescence et la densité optique des plaques de dosage (Jour 3).
      1. Retirez le ruban avec précaution et ne renversez pas de liquide hors des puits.
      2. Sur un lecteur de plaques, lisez la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀), GFP et mCherry.
         REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser un gain défini pour les deux canaux de fluorescence afin de permettre les comparaisons entre les dosages.
   9. Enregistrer les données sous forme de fluorescence normalisée par cellule : GFP/OD₆₀₀ et mCherry/OD₆₀₀.
   10. Tracez le graphique des données, comme le montre la figure 5, pour illustrer les résultats du contrôle DMSO par rapport aux échantillons d’essai.

4. Lavage des plaques de test noires pour la réutilisation

1. Trempez les assiettes dans de l’eau de Javel.
   1. Étiquetez un bécher en plastique de 1 L comme « déchet biologique ». Versez le liquide des plaques dans ce conteneur à déchets (nettoyez soigneusement les gouttes avec 70% d’EtOH). Rincez les plaques avec de l’eau DI de la bouteille à jet d’eau sur les déchets et versez-les dedans.
   2. Étiquetez un autre bécher en plastique de 1 L comme « eau de Javel à 30 % ». Mettez les assiettes/couvercles dans ce récipient et couvrez avec 30% d’eau de Javel. Enveloppez le dessus avec une feuille de plastique et pesez les plaques avec une boîte à pointes ou quelque chose de similaire. Laisser reposer immergé dans la solution d’eau de Javel pendant la nuit.
2. Rincez et trempez dans de l’éthanol.
   1. Rincez abondamment les plaques avec de l’eau DI dans l’évier afin qu’il ne reste pas d’eau de Javel. Videz toute l’eau restante des puits dans l’évier.
   2. Ajoutez 70 % d’EtOH à tous les puits et couvercles à l’aide d’un flacon pulvérisateur. Laissez les plaques reposer à la verticale avec le couvercle sur le dessus, mais de travers pour que l’EtOH puisse s’évaporer, mais rien ne tombe dans les puits. Laissez reposer l’assiette toute la nuit.
3. Laissez sécher les plaques.
   1. Jetez tout EtOH restant.
   2. Retournez l’assiette sur une serviette en papier et laissez le reste de l’EtOH s’évaporer. Laissez les plaques de cette façon dans une hotte. Les plaques seront prêtes pour la prochaine utilisation.

Résultats

À titre de résultats représentatifs, des données sont incluses à partir de trois composés de thiophènesulfonamide synthétisés par des étudiants de premier cycle pour les composés 1A, 2B et 3B (figures 5A-C ; décrites en détail dans Newman et al.⁹). Chaque composé a été testé dans la souche d’E. coli exprimant V. campbellii LuxR et utilisant le plasmide ra...

Discussion

Ce CURE a été développé à l’origine comme un protocole abrégé en deux étapes de trois semaines (conception/synthèse et essai) et a été mis en œuvre en cinq semestres dans le cadre d’un cours de laboratoire organique de niveau supérieur⁸. Depuis le rapport original, le module de modélisation informatique a été ajouté et le test E . coli a été optimisé pour les chercheurs novices. Le protocole en trois étapes et deux semestres qui e...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-thiophensulfonyl chloride	Ambeed	A258464
3-Phenyl-1H-pyrazole	Ambeed	A104401	98%
96-well clear bottom black plates	USA Scientific	5665-5090Q	96-well polystyrene uClear black TC plate with lid, clear flat bottom, sterile, 8/sleeve, 32/case
Autodock Tools			http://mgltools.scripps.edu/downloads
Autodock Vina			https://vina.scripps.edu
Chloramphenicol
DMSO
ethyl acetate	Fisher Scientific	AA31344M4	Reagent grade
hexanes	Fisher Scientific	H291
Kanamycin
magnesium sulfate	Fisher Scientific	M65-500	Anhydrous
Microporous Film	USA Scientific	2920-1010	Microporous Film, -20degC to +80degC, 50/box, Sterilized
molview			molview.org
NaCl
Protein Databank			https://www.rcsb.org/
Pymol			https://pymol.org/2/
Qualitative filter paper	Fisher Scientific	09-805-342	Cytiva Whatman™ Qualitative Filter Paper: Grade 1 Circles, 47 mm
Silica gel	Sorbtech	30930M-25	Silica Gel, Standard Grade, 60A, 40-63um (230 x 400 mesh)
Sodium hydride	Millipore Sigma	452912	60 % dispersion in mineral oil
Tetrahydrofuran	Fisher Scientific	MTX02847	Tetrahydrofuran, anhydrous, 99.9%, ACS Grade, DriSolv
TLC Plates	Sorbtech	1634067	Silica gel TLC plates, aluminum backed
Tryptone
webina			https://durrantlab.pitt.edu/webina/
Yeast Extract