Préparation d’échantillons d’organoïdes rétiniens pour la microscopie électronique à transmission

Résumé

Ce protocole fournit une procédure de préparation optimisée et élaborée pour les échantillons d’organoïdes rétiniens pour la microscopie électronique à transmission. Il convient aux applications qui impliquent l’analyse des synapses dans les organoïdes rétiniens matures.

Résumé

Les organoïdes rétiniens (OI) sont un système de culture tridimensionnel imitant les caractéristiques rétiniennes humaines qui se sont différenciées des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) dans des conditions spécifiques. Le développement et la maturation des synapses dans les OI ont été étudiés immunocytochimiquement et fonctionnellement. Cependant, les preuves directes de l’ultrastructure de contact synaptique sont limitées, contenant à la fois des synapses de ruban spéciales et des synapses chimiques conventionnelles. La microscopie électronique à transmission (MET) se caractérise par une haute résolution et une histoire respectable élucidant le développement de la rétine et la maturation des synapses chez l’homme et diverses espèces. Il s’agit d’un outil puissant pour explorer la structure synaptique des OI et est largement utilisé dans le domaine de la recherche sur les OI. Par conséquent, pour mieux explorer la structure des contacts synaptiques de l’OI à l’échelle nanométrique et obtenir des preuves microscopiques de haute qualité, nous avons développé une méthode simple et reproductible de préparation d’échantillons TEM d’OI. Cet article décrit le protocole, les réactifs utilisés et les étapes détaillées, y compris la préparation de la fixation de l’OI, la post-fixation, l’intégration et la visualisation.

Introduction

La rétine, un organe sensoriel visuel vital chez l’homme et les mammifères, présente une structure laminée distincte caractérisée par trois couches nucléaires abritant des somas neuronaux et deux couches plexiformes formées par des connexions synaptiques¹, y compris les synapses conventionnelles et la synapse de ruban spécialisée ^2,3. La synapse du ruban joue un rôle crucial dans la transmission des impulsions des vésicules de manière graduée ^2,3. Le processus de vision implique la transmission ....

Protocole

1. Obtention d’offices récepteurs auprès des iPSC²⁵

REMARQUE : Les OI ont été dérivées des iPSC en modifiant la procédure précédemment signalée.

1. Dissocier les iPSC à ~90% de confluence à l’aide d’une protéase bactérienne (voir le tableau des matériaux). Coupez les colonies en morceaux et grattez-les avec un élévateur de cellules.
2. Après le prélèvement, remettre en suspension les grappes de cellules dans 0,25 mL de Matrigel glacé. Après 20 min d’incubation à 37 °C, disperser le gel solidifié avec le milieu DMEM/F12 ....

Discussion

Dans cet article, nous avons présenté un protocole détaillé pour l’observation de l’ultrastructure synaptique conventionnelle et en ruban dans les OI par TEM. Ce protocole est basé sur les méthodes de préparation rétinienne décrites précédemment, avec quelques modifications²⁰. Pour améliorer le taux de réussite du traitement des échantillons et la qualité des micrographies TEM, tenez compte des points clés suivants. Tout d’abord, il est impor.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Corning	430167
Acetone	Electron Microscopy Science	10000
B27 supplement	Gibco	A3582801
Cell lifter	Santa Cruz	sc-395251
Copper grids	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	AZH400HH
DigitalMicrograph Software	Gatan, Inc.		Software
Dispase	StemCell Technologies	#07913	Bacterial protease
DMEM/F12 medium	Gibco	#11320033
Embedding mold	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ10592
Epon-812 resin	Electron Microscopy Science	#14900
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biological Industries	#04-0021A
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Science	16020
hiPSC	Shownin Biotechnology Co. Ltd.	RC01001-A
Lead citrate	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd.	GZ02618
L-GlutaMax	Life Technologies	#35050061	L-glutamine substitute
Matrigel	Corning	356234
Microscope slide	CITOTEST	80312-3161
N2 supplement	Gibco	17502048
Na2HPO4· 12H2O	Sigma	71650	A component of PB/PBS
NaH2PO4· H2O	Sigma	71507	A component of PB/PBS
Non-essential amino acids	Sigma	#M7145
Optical microscope	Lab Binocular Biological Microscope	Xsz-107bnii
OsO4	TED PELLA	4008-160501
Oven	Bluepard	BPG9040A
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Science	157-8
Penicillin-Streptomycin	Gibco	#15140-122
Semi/ultrathin microtome	Reichert-Jung	396649
Taurine	Sigma	#T0625
Toluidine blue	Sangon Biotech	E670105-0100
Transmission Electron Microscopes	HITACHI	H-7500
Uranyl acetate	TED PELLA	CA96049
β-mercaptoethanol	Sigma	444203