Modèle d’intestin sur puce immunocompétent pour l’analyse des réponses immunitaires de la muqueuse intestinale

Résumé

Notre protocole détaillé décrit la création et l’utilisation du modèle avancé d’intestin sur puce, qui simule la muqueuse intestinale humaine avec des structures 3D et divers types de cellules, permettant une analyse approfondie des réponses immunitaires et des fonctions cellulaires en réponse à la colonisation microbienne.

Résumé

Un modèle avancé d’intestin sur puce recréant des structures épithéliales organotypiques 3D semblables à des villosités et à des cryptes a été développé. Le modèle immunocompétent comprend des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC), des cellules épithéliales intestinales Caco-2, des macrophages résidant dans les tissus et des cellules dendritiques, qui s’auto-organisent au sein du tissu, reflétant les caractéristiques de la muqueuse intestinale humaine. Un aspect unique de cette plateforme est sa capacité à intégrer les cellules immunitaires primaires humaines circulantes, améliorant ainsi la pertinence physiologique. Le modèle est conçu pour étudier la réponse du système immunitaire intestinal à la colonisation et à l’infection bactériennes et fongiques. En raison de la taille de sa cavité élargie, le modèle offre diverses lectures fonctionnelles telles que les tests de perméation, la libération de cytokines et l’infiltration des cellules immunitaires, et est compatible avec la mesure par immunofluorescence des structures 3D formées par la couche de cellules épithéliales. Il fournit ainsi des informations complètes sur la différenciation et la fonction cellulaires. La plateforme d’intestin sur puce a démontré son potentiel dans l’élucidation d’interactions complexes entre les substituts d’un microbiote vivant et le tissu de l’hôte humain au sein d’une plateforme de biopuce perfusée microphysiologique.

Introduction

Les systèmes d’organes sur puce (OoC) représentent une technique émergente de culture cellulaire 3D capable de combler le fossé entre la culture cellulaire 2D conventionnelle et les modèles animaux. Les plateformes OoC se composent généralement d’un ou plusieurs compartiments contenant des cellules spécifiques aux tissus cultivées sur une large gamme d’échafaudages tels que des membranes ou des hydrogels¹. Les modèles sont capables d’imiter une ou plusieurs fonctions organotypiques définies. Les pompes permettent la perfusion microfluidique continue de milieux de culture cellulaire pour l’élimination des déchets cellulaires, l’alimentation en facteurs de nutrition et de croissance pour une meilleure différenciation cellulaire et la recréation de conditions in vivo essentielles. Grâce à l’intégration des cellules immunitaires, les systèmes OoC peuvent imiter la réponse immunitaire humaine in vitro². À ce jour, un large éventail d’organes et d’unités fonctionnelles ont été présentés¹. Ces systèmes comprennent des modèles du système vasculaire³, du poumon⁴, du foie ^2,5 et de l’intestin⁶ qui peuvent être facilités pour les tests de dépistage de drogues ^5,7 et les études d’infection ^6,8.

Nous présentons ici un modèle d’intestin humain sur puce intégrant des cellules épithéliales humaines formant une topographie 3D organotypique de structures ressemblant à des villosités et à des cryptes combinées à une muqueuse endothéliale et à des macrophages résidant dans les tissus. Le modèle est cultivé dans une biopuce perfusée de manière microfluidique sous la forme d’une lame microscopique. Chaque biopuce se compose de deux cavités microfluidiques distinctes. Chaque cavité est divisée par une membrane poreuse en polyéthylène téréphtalate (PET) en une chambre supérieure et une chambre inférieure. La membrane elle-même sert également d’échafaudage pour que les cellules se développent de chaque côté. Les pores de la membrane permettent la diaphonie cellulaire et la migration cellulaire entre les couches cellulaires. Chaque chambre est accessible par deux orifices femelles de la taille d’un Luer Lock. En option, un orifice supplémentaire de la taille d’un mini-luer peut permettre d’accéder à la chambre supérieure ou inférieure (Figure 1).

La plate-forme OoC offre un certain nombre de lectures qui peuvent être obtenues à partir d’une seule expérience. L’intestin sur puce est conçu pour combiner la culture cellulaire 3D perfusée, l’analyse des effluents et la microscopie à fluorescence pour évaluer l’expression des marqueurs cellulaires, les taux de métabolisation, la réponse immunitaire, la colonisation et l’infection microbiennes, et la fonction barrière ^3,6,8. Le modèle comprend des cellules immunitaires résidentes des tissus et un contact direct de micro-organismes vivants avec le tissu hôte, ce qui est un avantage par rapport aux autres modèles publiés⁹. De plus, les cellules épithéliales s’auto-organisent en structures tridimensionnelles qui fournissent une interface physiologiquement pertinente pour la colonisation avec un microbiote vivant⁶.

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Protocole

Ce protocole exige l’accès à ~20 ml de sang frais par biopuce provenant de donneurs sains afin d’isoler les monocytes humains primaires. Tous les donateurs ont donné leur consentement écrit et éclairé pour participer à cette étude, qui a été approuvée par le comité d’éthique de l’hôpital universitaire d’Iéna (numéro d’autorisation 2018-1052-BO). Pour plus de détails sur les matériaux, reportez-vous à la Table des matériaux. Pour plus de détails sur la composition de toutes les solutions et de tous les milieux, reportez-vous au tableau 1.

1. Remarques générales sur la manipulation des biopuces

1. Séparez soigneusement une bande de réservoirs et détachez les couvercles à l’aide d’un couteau chauffé pour obtenir des réservoirs et des couvercles uniques. Élargissez le trou du couvercle pour que le tube en silicone soit bien ajusté.
2. Le tube en silicone a un diamètre intérieur de 0,5 mm, est asymétrique et est séparé en côtés plus longs (20 cm) et plus courts (12 cm) par deux bouchons de pompe péristaltiques. Assemblez deux tubes de chaque symétrie par biopuce en fixant un tube à un connecteur Luer Lock mâle et le couvercle sur le côté opposé du tube. Assemblez également quatre réservoirs par biopuce.
   REMARQUE : Préparez les tubes et les réservoirs à l’avance et stérilisez-les à l’autoclave avant utilisation. Comme le tube en silicone a une durée de vie limitée, remplacez-le après 3 à 5 expériences. Pour certains intérêts de recherche, tels que les tests de drogues, il est conseillé de préparer de nouveaux tubes pour chaque expérience. De nombreuses étapes de ce protocole se déroulent en parallèle ; reportez-vous à la figure d’ensemble, qui met en évidence les différentes étapes effectuées au cours d’une même journée, comme le montre la figure 2.

Figure 1 : Représentation schématique d’un modèle d’intestin sur puce. (A) La biopuce est présentée en coupe transversale. (B) La dimension de l’ensemble de la biopuce ainsi que de la membrane PET plate et amovible est visible. Le volume total de la chambre supérieure, y compris les orifices femelles de la taille d’un Luer Lock, est de 290 μL et de 270 μL pour la chambre inférieure, respectivement. (C) Une composition schématique de la biopuce intestinale, de l’épithélium de croissance tridimensionnel ressemblant à des villosités et à des structures cryptiques, y compris des cellules immunitaires différenciées et une couche de mucus, peut être observée. L’autre côté de la membrane PET est recouvert d’une monocouche endothéliale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Vue d’ensemble schématique de la chronologie de construction du modèle et de la configuration expérimentale. Cette figure montre la vue d’ensemble schématique du protocole présenté. Les procédures importantes, telles que l’ensemencement des cellules et le défi épithélial avec le LPS, sont indiquées par des flèches. Abréviations : HUVECs = cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines ; LPS = lipopolysaccharide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Stérilisation par biopuce

1. Remplissez une boîte de Pétri en verre stérile d’un diamètre de 15 cm avec 70 % d’éthanol non dénaturé. Placez la biopuce à l’intérieur de manière à ce que tous les ports de la biopuce soient complètement recouverts par la solution d’éthanol.
2. Deux fois par orifice, tirez 1 ml d’éthanol à 70 % à travers toutes les chambres de la puce. Incuber pendant 45-60 min à température ambiante (RT).
   REMARQUE : Assurez-vous qu’aucun air n’est emprisonné à l’intérieur de la biopuce. À partir de ce moment, aucun air ne doit pénétrer dans le système de biopuce et les cavités doivent rester remplies de liquide.
3. Retirez l’éthanol dans la boîte de Pétri et remplacez-le par de l’eau stérile bidistillée (ddH₂O) jusqu’à ce que tous les ports soient complètement couverts. Encore une fois, deux fois par port, aspirez 1 mL de ddH₂O à travers la cavité de la biopuce. Rafraîchissez le ddH₂O dans la boîte de Pétri et répétez la procédure.
4. Retirez tout le liquide de la boîte de Pétri. Par la suite, conservez les biopuces entièrement stérilisées à l’intérieur de la boîte de Pétri fermée chaque fois qu’elles se trouvent à l’extérieur d’un environnement stérile. Ajoutez un petit réservoir (p. ex., le couvercle d’un tube de 50 ml) de 2 à 5 mL de ddH₂O dans la boîte de Pétri pour réduire l’évaporation du liquide à l’intérieur de la biopuce.
   REMARQUE : Les biopuces peuvent être stérilisées jusqu’à 3 jours à l’avance si elles sont conservées dans un environnement stérile jusqu’à leur utilisation. Cela permet une flexibilité dans la charge de travail en une seule journée.

3. Récolte et ensemencement des HUVECs

REMARQUE : Les cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines (HUVEC) ont été isolées à partir des cordons ombilicaux, comme publié avant¹⁰.

1. Avant d’ensemencer les HUVEC, enduisez la membrane de collagène humain IV. Pour cela, préparez une dilution 1:100 d’une solution mère de collagène (tableau 1) dans la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco contenant du magnésium et du calcium (PBS +/+). Ajoutez 350 μL de la solution mère diluée dans la chambre correspondante. Incuber pendant 5 min à RT.
   REMARQUE : Si vous manipulez la biopuce dans le capot stérile, nous vous recommandons de placer un tissu stérile en dessous pour recueillir l’excès de milieu.
2. Rincez toutes les chambres deux fois avec 350 μL de PBS +/+ pour éliminer le collagène et l’acide acétique restants. Ensuite, ajoutez 350 μL de milieu de croissance cellulaire endothéliale (EC) dans chaque chambre.
   REMARQUE : À partir de là, les biopuces sont prêtes pour l’ensemencement cellulaire et peuvent être stockées à 37 °C jusqu’à leur utilisation.
3. Utilisez les HUVECs aux passages 1 à 3 à 80-90 % de confluence des cellules. Cultivez des HUVECs dans un milieu EC contenant un mélange de suppléments défini fourni par le fabricant. Une image représentative en fond clair d’une culture cellulaire HUVEC est présentée à la figure 3A.
   REMARQUE : Selon le donneur, les HUVECs des passages supérieurs peuvent commencer à se dédifférencier et ne peuvent pas former de manière fiable une monocouche dense et confluente à l’intérieur de la biopuce. L’utilisation d’antibiotiques, c’est-à-dire 100 μg/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine, est facultative, mais recommandée en complément du milieu EC pour prévenir la contamination microbienne.
4. Retirer le milieu de culture cellulaire d’un flacon de culture cellulaire T25 et laver délicatement les cellules avec 3 à 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans magnésium ni calcium (PBS -/-). Retirer le PBS -/- et ajouter 1 mL de réactif de dissociation de la trypsine (tableau 1). Incuber pendant 5 min à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent de la fiole de culture cellulaire.
5. Transférez les cellules détachées dans un tube à l’aide de 9 ml de sérum de veau fœtal (FBS) à 5 % dans du PBS -/-. Centrifuger à 350 × g pendant 5 min à RT. Retirer le surnageant, remettre en suspension dans 1 mL de milieu EC et déterminer le nombre de cellules. Ajuster la concentration cellulaire à 0,4 × 10⁶ cellules par 150 μL (ensemencement dans la chambre inférieure) ou par 250 μL (ensemencement dans la chambre supérieure).
6. Ajoutez le volume respectif de cellules dans la chambre. En cas d’ensemencement dans la chambre inférieure, fermez tous les orifices et positionnez immédiatement la biopuce à l’envers pour que les cellules tombent sur la membrane PET. Incuber les biopuces dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO₂.
7. Effectuez un remplacement du fluide de la chambre contenant HUVEC avec 350 μL de fluide EC après 24 h. Le fluide dans la chambre opposée n’a pas besoin d’être remplacé.

4. Prélèvement de sérum humain et isolement de monocytes dérivés de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC)

REMARQUE : Les PBMC ont été isolés comme décrit dans Mosig et ^al.11.

1. Prélever du sang veineux humain de donneurs sains. Par biopuce, procurez-vous un minimum de 10 ml de sang total dans des tubes de prélèvement sanguin contenant du silicate pour le prélèvement du sérum. Après une coagulation complète, centrifuger les tubes de prélèvement sanguin à 2 500 × g pendant 10 min à RT. Prélever le sérum, l’aliquote et le conserver à -20 °C jusqu’à nouvel ordre.
2. Procurez-vous un minimum de 10 ml de sang total du même donneur dans des tubes de prélèvement sanguin contenant de l’EDTA pour l’isolement des PBMC. Mélangez doucement le sang non coagulé 1:1 avec un iso-tampon (tableau 1) par inversion et superposez lentement 35 mL de ce mélange sur 15 mL d’un milieu à gradient de densité de 1,077 g/mL dans un tube de 50 mL.
3. Centrifuger à 800 × g pendant 20 min sans frein à RT. Retirer soigneusement la couche de cellules immunitaires résultante, apparaissant au-dessus du milieu à gradient de densité, et la transférer dans un nouveau tube de 50 mL. Remplissez jusqu’à 50 ml d’iso-tampon froid et lavez les cellules par inversion douce.
4. Centrifugeuse à 200 × g pendant 8 min sans frein à 4 °C. Jeter le surnageant et le remettre en suspension dans 10 mL d’iso-tampon par gradient de densité. Facultatif : Regroupez les PBMC d’un donateur si plusieurs gradients sont exécutés en parallèle.
5. Centrifuger à 150 × g pendant 8 min à 4 °C. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 10 mL d’iso-tampon par gradient de densité. Répétez l’étape de centrifugation 4.4. Enfin, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 2 mL de milieu de différenciation des monocytes (tableau 1).
   REMARQUE : L’ajout de M-CSF et de GM-CSF renforce la différenciation des monocytes isolés en macrophages dérivés de monocytes et en cellules dendritiques dérivées de monocytes (en combinaison avec le lipopolysaccharide [LPS], qui est ajouté ultérieurement dans ce protocole). L’utilisation d’antibiotiques, c’est-à-dire 100 μg/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine, est facultative, mais recommandée en complément du milieu pour prévenir la contamination microbienne.
6. Déterminer le nombre de cellules et la graine ~10 × 10⁶ cellules par puits d’une plaque à 6 puits dans 2 mL de milieu de différenciation des monocytes (tableau 1). Incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C pendant 1 h pour permettre la fixation des monocytes sur le plastique de la plaque à 6 puits.
7. Jetez soigneusement le surnageant et lavez-le 2 fois avec 2 ml de milieu cellulaire hématopoïétique préchauffé pour éliminer les cellules non liées. Incuber à 37 °C pendant encore 24 h dans un milieu de différenciation des monocytes.
8. Pour récolter les monocytes, jetez soigneusement le surnageant et lavez-le une fois avec 2 ml de PBS -/-. Voir la figure 3B pour un exemple d’image en fond clair de la culture de monocytes à ce stade. Ensuite, incubez les cellules pendant 7 minutes dans 1 mL de réactif de détachement des monocytes préchauffé (tableau 1) à 37 °C pour renforcer le détachement des monocytes du plastique de la plaque à 6 puits.
9. Transférez les monocytes détachés dans un tube à faible liaison. Facultatif : pour obtenir un rendement cellulaire plus élevé, lavez soigneusement la plaque à 6 puits plusieurs fois avec du PBS -/-.
10. Centrifuger à 300 × g pendant 8 min à RT. Jeter le surnageant et le remettre en suspension dans un milieu conditionné par EC (Tableau 1). Déterminer le nombre de cellules et ajuster la concentration cellulaire à 0,1 × 10⁶ cellules par 150 μL (ensemencement dans la cavité inférieure) ou par 250 μL (ensemencement dans la cavité supérieure).
    REMARQUE : Soyez doux à toutes les étapes de l’isolement des cellules immunitaires et réduisez les forces de cisaillement pour empêcher l’activation des cellules immunitaires. Lors de l’établissement de cet isolement, vérifiez la pureté des monocytes dérivés du PBMC (par exemple, par cytométrie en flux). Plus de 95 % de toutes les cellules devraient être positives pour les marqueurs monocytaires typiques tels que CD14.

5. Ensemencement des monocytes

1. Effectuez un remplacement de fluide dans la chambre contenant HUVEC avec 350 μL de fluide préchauffé conditionné par EC.
2. Ajouter 150 μL (chambre inférieure) ou 250 μL (chambre supérieure) de la suspension de monocytes préparée (voir étape 4.10) dans la même chambre. En cas d’ensemencement dans la chambre inférieure, fermez tous les orifices et positionnez immédiatement la biopuce à l’envers pour que les cellules tombent sur la couche HUVEC. Incuber la biopuce dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO₂.
3. Effectuez un échange de fluide dans la chambre contenant des monocytes HUVEC + avec 350 μL de fluide conditionné CE toutes les 24 h.

6. Récolte et semis C2BBe1

REMARQUE : Les cellules exprimant la bordure en brosse Caco-2 1 (C2BBe1)¹² sont utilisées jusqu’au passage 35 et sont prélevées dans des flacons de 80-90% de confluence. Une image représentative en fond clair d’une culture C2BBe1 est présentée à la figure 3C.

1. Cultivez des cellules C2BBe1 dans un milieu C2 (tableau 1).
   REMARQUE : L’utilisation d’antibiotiques, c’est-à-dire 20 μg/mL de gentamicine, est facultative, mais recommandée en complément du milieu C2 pour prévenir la contamination microbienne.
2. Retirer le milieu de culture cellulaire d’une fiole de culture cellulaire T25 et laver délicatement les cellules avec 3 à 5 mL de PBS -/-. Retirer le PBS -/- et ajouter 1 mL de réactif de dissociation de la trypsine (tableau 1). Incuber pendant 5 min à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent de la fiole de culture cellulaire.
3. Transférez les cellules détachées dans un tube en utilisant 9 mL de sérum de veau fœtal (FBS) à 5 % dans du PBS -/-. Centrifuger à 350 × g pendant 5 min à RT. Retirer le surnageant, le remettre en suspension dans 1 mL de milieu C2 et déterminer le nombre de cellules. Ajuster la concentration cellulaire à 0,5 × 10^{à 6} cellules par 150 μL (ensemencement dans la chambre inférieure) ou par 250 μL (ensemencement dans la chambre supérieure).
4. Avant l’ensemencement du C2BBe1, lavez délicatement la chambre correspondante avec 350 μL de milieu C2.
5. Ajouter 150 μL (chambre inférieure) ou 250 μL (chambre supérieure) de la suspension C2BBe1 préparée (voir étape 6.3) dans la chambre correspondante. En cas d’ensemencement dans la chambre inférieure, fermez tous les orifices et positionnez immédiatement la biopuce à l’envers pour que les cellules tombent sur la membrane PET. Incuber les biopuces dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO₂.

Figure 3 : Morphologie cellulaire des HUVEC, des monocytes et du C2BBe1 avant l’ensemencement dans la biopuce. Cette figure montre des images représentatives en fond clair des différentes sources de cellules utilisées dans l’ensemble du protocole. Les images ont été prises avec un microscope à fond clair inversé avec un grossissement de 10x. Tous les types de cellules, (A) les HUVEC, (B) les monocytes et (C) le C2BBe1 ont été cultivés en culture cellulaire monocouche 2D comme décrit dans leurs sections de protocole spécifiques. Barres d’échelle = 200 μm. Abréviations : HUVECs = cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines ; PBMC = cellules mononucléées du sang périphérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

7. Raccordement à la pompe péristaltique et perfusion circulaire

1. Préparez un incubateur vide avec l’ajout d’une pompe péristaltique. Nettoyez soigneusement toutes les zones de l’incubateur et pompez avec un désinfectant pour créer un environnement quasi stérile.
   REMARQUE : Les pompes péristaltiques peuvent produire beaucoup de chaleur pendant le travail. Dans les incubateurs bien isolés ou les laboratoires mal climatisés, le nombre de pompes utilisables par incubateur peut être limité car les incubateurs ont tendance à surchauffer. Deux pompes péristaltiques par incubateur devraient suffire.
2. Avant de fixer les tubes stérilisés à la biopuce, rincez chaque tube avec 700 μL de PBS +/+ suivi de 500 μL de milieu C2 ou de milieu conditionné EC. Préparez un tube de chaque symétrie par milieu (voir étape 1.2). Utilisez le tube avec la courte distance entre l’écluse Luer et le bouchon de pompe péristaltique pour la cavité gauche et le tube avec l’autre symétrie pour la cavité droite.
3. Récupérez la biopuce de l’incubateur et effectuez un échange de fluide avec 350 μL pour chaque chambre. Retirez toutes les fiches et remplissez tous les ports jusqu’en haut.
4. En commençant par la cavité gauche, connectez le premier tube à l’orifice droit de la chambre supérieure en insérant l’adaptateur Luer Lock dans l’orifice de la biopuce. Ensuite, connectez le deuxième tube à l’orifice gauche de la chambre inférieure. Répétez cette procédure pour la cavité microfluidique droite.
5. Prenez un réservoir et ajoutez une petite goutte de milieu de culture cellulaire au fond du réservoir. Ensuite, insérez le réservoir du côté opposé du premier tube et répétez l’opération pour l’autre chambre. Une fois que tous les orifices sont connectés à un tube ou à un réservoir, remplissez les réservoirs avec 3,5 ml de milieu de culture cellulaire.
6. Placez le côté lâche du tube, auquel est fixé le couvercle, sur le dessus du réservoir pour fermer le système microfluidique de chaque chambre. Dans cet état, transportez la biopuce vers la pompe péristaltique.
   REMARQUE : En fonction de la distance par rapport à l’incubateur et de l’environnement du laboratoire, une boîte préalablement nettoyée et autoclavée peut être utilisée pour transférer les puces vers l’incubateur.
7. Utilisez les bouchons de pompe péristaltique pour connecter le tube à la pompe. Raccordez chaque tube à la pompe péristaltique de manière à ce que le fluide s’écoule du réservoir dans la cavité, dans le tube et, via la pompe, dans le réservoir (Figure 4). Le réservoir sert de piège à bulles dans la perfusion circulaire et empêche l’air de s’emprisonner dans le système. Perfusion de chaque chambre avec un débit de 50 μL/min, ce qui entraîne une contrainte de cisaillement de 0,013 dyn/cm² dans la chambre supérieure et de 0,006 dyn/cm² dans la chambre inférieure⁸.
   REMARQUE : Si le milieu des cavités inférieure et supérieure est déplacé dans des directions opposées, une excroissance tridimensionnelle plus élevée du tissu intestinal peut être obtenue¹³. Par conséquent, les réservoirs des cavités supérieure et inférieure sont placés sur des côtés opposés (Figure 4). La perfusion circulaire réduit la quantité de milieu de culture cellulaire nécessaire, mais pourrait potentiellement entraîner l’enrichissement des cytokines et des métabolites. Si vous le souhaitez, une perfusion linéaire de la biopuce est également possible.
8. Perfuser la biopuce pendant 72 h à 37 °C et 5% de CO₂.

Figure 4 : Biopuce connectée à une pompe péristaltique. Un exemple de biopuce connectée à une pompe péristaltique est présenté. Les cellules épithéliales C2BBe1 sont cultivées dans la chambre inférieure (le milieu C2 rouge se trouve dans les réservoirs à l’avant) tandis que les HUVECs sont cultivés dans la chambre supérieure (le milieu jaunâtre conditionné par l’EC se trouve dans les réservoirs à l’arrière). Les différents milieux de culture cellulaire ne se mélangent pas en raison de la fonction barrière du tissu cultivé. La biopuce est reliée à la pompe péristaltique de telle sorte que le fluide s’écoule du réservoir dans la cavité. De là, le fluide retourne dans le réservoir à travers le tube via la pompe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

8. Conditionnement LPS de la barrière épithéliale

1. Après 72 h de préperfusion, arrêtez la pompe péristaltique et retirez le couvercle relié au tube de chaque réservoir. Placez-le sur un mouchoir stérile à côté de la pompe.
2. Retirer tout le milieu et remplir les réservoirs de 2 ml de milieu fraîchement préparé. Pour le côté épithélial contenant les cellules C2BBe1, ajoutez 100 ng/mL de LPS au milieu.
   REMARQUE : Le LPS augmente la fonction barrière du tissu, stimule la migration des macrophages dérivés des monocytes dans le tissu épithélial et permet la différenciation des cellules dendritiques dérivées des monocytes.
3. Reconnectez le tube et les couvercles au réservoir et poursuivez la perfusion circulaire à un débit de 50 μL/min pendant 24 h supplémentaires.
   REMARQUE : À partir de ce moment, le modèle de puce peut être utilisé dans des expériences, des tests de composés ou des études d’infection. Nous recommandons un remplacement moyen de 2 mL par réservoir toutes les 24 h.

9. Accès au tissu pour différentes méthodes de lecture

1. Prélever les surnageants du milieu de culture cellulaire dans les réservoirs en tout temps de la perfusion. Ouvrez le réservoir et récupérez le volume souhaité (voir étapes 8.1-8.3). Utilisez ces surnageants pour la détection de métabolites, de cytokines ou d’autres molécules.
2. Pour accéder au tissu, utilisez un scalpel pour faire une coupe précise le long de l’extérieur de la chambre supérieure et retirez la feuille de liaison pour ouvrir la cavité microfluidique. Le tissu du modèle de biopuce intestinale est maintenant accessible. Coupez soigneusement le long de l’extérieur de la chambre microfluidique pour détacher la membrane de la biopuce. Prélever la membrane contenant le tissu à l’aide d’une pince à épiler.
   ATTENTION : Faites attention au placement des doigts pendant cette étape et travaillez avec précaution pour éviter les accidents. Des gants résistants aux coupures sont recommandés.
3. Vous pouvez également prélever les cellules à partir de couches distinctes à l’intérieur de la biopuce à l’aide de solutions enzymatiques, c’est-à-dire de trypsine ou de cellules lysées à l’aide de tampons contenant du Triton X-100.

10. Évaluation de la perméabilité par diffusion FITC-dextran

REMARQUE : La fonction barrière du tissu peut être analysée via un test de perméabilité FITC-dextran après déconnexion de la pompe péristaltique. L’évaluation de la perméabilité FITC-dextran a été adaptée de Deinhardt-Emmer et ^al.4.

1. Préparez une solution mère d’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextran (poids moléculaire de 3 à 5 kDa, tableau 1).
2. Videz les réservoirs et débranchez la puce de la perfusion.
3. Effectuez un échange de fluide dans les chambres supérieure et inférieure avec un milieu sans rouge de phénol.
   REMARQUE : Cette étape n’est pas nécessaire si un milieu sans rouge de phénol a déjà été utilisé pendant l’expérience.
4. Ajouter 350 μL de solution de FITC-dextran à 1 mg/mL dans la chambre contenant les cellules C2BBe1.
5. Fermez les orifices et incubez la puce pendant 60 min à 37 °C, le côté épithélial vers le haut.
6. Après le temps d’incubation, prélever le milieu de culture dans les deux chambres de la puce séparément et le stocker à 4 °C, à l’abri de la lumière jusqu’à la mesure.
7. Pour la mesure, préparer une courbe standard en milieu C2 et le milieu conditionné CE sans rouge de phénol dans la plage de 1 000 μg/mL à 0 μg/mL de FITC-dextran avec 11 dilutions consécutives en série 1:2.
8. Transvaser 200 μL de chaque échantillon dans une plaque noire de 96 puits à fond transparent. Mesurez la fluorescence avec un lecteur de microplaques à une longueur d’onde d’excitation de 495 nm et une longueur d’onde d’émission de 517 nm.
9. Utilisez la courbe standard pour calculer la concentration FITC-dextran des échantillons et, par conséquent, le coefficient de perméabilité.

11. Coloration par immunofluorescence

REMARQUE : Les tissus vivants peuvent être étudiés au microscope. Pour faciliter la manipulation, nous recommandons le détachement de la biopuce de la pompe péristaltique et l’utilisation d’objectifs longue distance sur un microscope inversé. En tant qu’analyse finale, le tissu peut être fixé à l’intérieur de la biopuce pour des procédures telles que la coloration par immunofluorescence.

1. Arrêtez la pompe péristaltique et ouvrez les réservoirs de toutes les cavités. Videz les réservoirs et débranchez la tubulure, ainsi que les réservoirs de la biopuce.
2. Deux fois par chambre, laver les cavités microfluidiques avec 500 μL de PBS +/+ froid. Ajouter 500 μL de méthanol glacé dans toutes les cavités et incuber pendant 15 min à -20 °C. Ensuite, deux fois par cavité, laver la chambre microfluidique avec 500 μL de PBS +/+.
   REMARQUE : D’autres méthodes de fixation, telles que la fixation avec du paraformaldéhyde à 4 % ou le fixateur de Carnoy, conviennent également. Après fixation, les puces peuvent être stockées à 4 °C ou procéder directement à la coloration par fluorescence immunitaire. ATTENTION : Les produits chimiques de fixation tels que le méthanol ou le paraformaldéhyde sont toxiques. Effectuez les tâches respectives sous une hotte et collectez les déchets en conséquence.
3. Ouvrez la puce comme décrit à l’étape 9.2 pour accéder au tissu. Coupez la membrane PET contenant du tissu en trois morceaux maximum pour la colorer en parallèle avec différents immunopanels.
4. Transférez chacun des morceaux de membrane dans une plaque séparée à 24 puits contenant une solution de blocage et de perméabilisation (tableau 1) à l’aide d’une pince à épiler de précision. Assurez-vous que la couche cellulaire d’intérêt est toujours tournée vers le haut pendant tout le processus de coloration. Incuber les morceaux de membrane pendant 30 min à RT.
   REMARQUE : Les meilleurs résultats de coloration sont obtenus en faisant correspondre le sérum à l’anticorps secondaire. Par exemple, si des anticorps secondaires sont obtenus à partir d’espèces de chèvres, nous recommandons l’utilisation de sérum de chèvre normal.
5. Transférez les morceaux de membrane sur une lame de verre propre à l’intérieur d’une chambre humide. Préparez le panneau d’anticorps primaires dans la solution de coloration (tableau 1) et ajoutez 50 μL à chaque morceau de membrane. Incuber toute la nuit à 4 °C.
   REMARQUE : La concentration optimale d’anticorps et l’efficacité de la coloration peuvent différer d’un fabricant à l’autre et d’un clone à l’autre. Nous vous recommandons de tester les panneaux de coloration au préalable dans une culture cellulaire 2D.
6. Après l’incubation, transférez les échantillons dans une plaque à 24 puits et lavez doucement les membranes pendant 3 x 5 minutes avec une solution de lavage (tableau 1).
7. Encore une fois, transférez les morceaux de membrane sur une lame de verre propre à l’intérieur d’une chambre humide. Préparez le panneau d’anticorps secondaire dans une solution de coloration (tableau 1) et ajoutez 50 μL à chaque morceau de membrane. Si nécessaire, ajoutez une contrecoloration nucléaire telle que le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou Hoechst. Incuber pendant 30 min à RT.
   REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec des fluorophores, gardez les échantillons à l’abri de la lumière pour éviter le photoblanchiment et augmenter la qualité de l’image.
8. Après l’incubation, transférez les échantillons dans une plaque à 24 puits et lavez doucement les membranes 2 x 5 min avec une solution de lavage (tableau 1). Ensuite, laver une fois avec PBS +/+ pendant 5 min.
9. Montez les morceaux de membrane sur une lame de verre propre à l’aide d’un support de montage à fluorescence et d’un verre de protection. Conserver à 4 °C jusqu’à l’obtention d’une imagerie microscopique.

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Résultats

Ces résultats représentatifs montrent les couches tissulaires distinctes du modèle d’intestin sur puce. Ils sont colorés par immunofluorescence comme décrit dans la section 11 du protocole. Les images ont été prises à l’aide d’un microscope à épifluorescence ou à fluorescence confocale sous forme d’empilements z et traitées selon une projection orthogonale. Voir la table des matériaux pour plus de détails sur la configuration microscopique et le logiciel. La fig...

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Discussion

Le protocole présenté détaille les étapes nécessaires à la génération d’un modèle d’intestin sur puce immunocompétent. Nous avons décrit des techniques spécifiques et des méthodes de lecture possibles telles que la microscopie d’immunofluorescence, l’analyse des cytokines et des métabolites, la cytométrie en flux, l’analyse des protéines et de la génétique, et la mesure de la perméabilité.

Le modèle décrit se compose de HUVEC primaires, de macrophages dérivés ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate black, clear bottom	Thermo Fisher	10000631	Consumables
Acetic acid	Roth	3738.4	Chemicals
Alexa Fluor 488 AffiniPure, donkey, anti-mouse IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	715-545-150	Secondary Antibody Vascular Staining and Epithelial Staining
Alexa Fluor 647 AffiniPure, donkey, anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	711-605-152	Secondary Antibody Epithelial Staining
Alexa Fluor 647, donkey, anti-rabbit IgG (H+L)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A31573	Secondary Antibody Vascular Staining
Axiocam ERc5s camera	Zeiss	426540-9901-000	Technical equipment
Basal Medium MV, phenol red-free	Promocell	C-22225	Cell culture consumables
Biochip	Dynamic 42	BC002	Microfluidic consumables
BSA fraction V	Gibco	15260-037	Cell culture consumables
C2BBe1 (clone of Caco-2)	ATCC	CRL-2102	Epithelial Cell Source
Chloroform	Sigma	C2432	Chemicals
CO2 Incubator	Heracell	150i	Technical equipment
Collagen IV from human placenta	Sigma-Aldrich	C5533	Cell culture consumables
Coverslips (24 x 40 mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592	Consumables
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-goat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	705-165-147	Secondary Antibody Vascular Staining
Cy3 AffiniPure, donkey, anti-rat IgG (H+L)	Jackson Immuno Research	712-165-150	Secondary Antibody Epithelial Staining
Descosept PUR	Dr.Schuhmacher	00-323-100	Cell culture consumables
DMEM high glucose	Gibco	41965-062	Cell culture consumables
DMEM high glucose w/o phenol red	Gibco	31053028	Cell culture consumables
DPBS (-/-)	Gibco	14190-169	Cell culture consumables
DPBS (+/+)	Gibco	14040-133	Cell culture consumables
EDTA solution	Invitrogen	15575-038	Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020	Cell culture consumables
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225	Cell culture consumables
Ethanol 96%, undenatured	Nordbrand-Nordhausen	410	Chemicals
Fetal bovine Serum	invitrogen	10270106	Cell culture consumables
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5 kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG	Chemicals
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023	Chemicals
Gentamycin (10mg/mL)	Sigma Aldrich	G1272	Cell culture consumables
GlutaMAX Supplement (100x)	Gibco	35050061	Cell culture consumables
Histopaque	Sigma-Aldrich	10771	Cell culture consumables
Hoechst (bisBenzimid) H33342	Sigma-Aldrich	14533	Epithelial Staining
Holotransferrin (5mg/mL) Transferrin, Holo, Human Plasma	Millipore	616397	Cell culture consumables
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30	Cell culture consumables
Human recombinant M-CSF	Peprotech	300-25	Cell culture consumables
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C	Fluorescence Microscope Setup
Laser Scanning Microscope	Zeiss	CLSM980	Fluorescence Microscope Setup
Lidocain hydrochloride	Sigma-Aldrich	L5647	Cell culture consumables
Lipopolysaccharide (LPS)	Sigma	L2630	Cell culture consumables
Loftex Wipes	Loftex	1250115	Consumables
Low attachment tubes (PS, 5 mL)	Falcon	352052	Consumables
Luer adapter for the top cap (M)	Mo Bi Tec	M3003	Microfluidic consumables
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09	Microfluidic consumables
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140	Cell culture consumables
Methanol	Roth	8388.2	Chemicals
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5	Fluorescence Microscope Setup
Microscope slides	Menzel	MZ-0002	Consumables
Monoclonal, mouse, anti-human CD68 Antibody (KP1)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	14-0688-82	Primary Antibody Vascular Staining
Monoclonal, rat, anti-human E-Cadherin antibody (DECMA-1)	Sigma-Aldrich, Millipore	MABT26	Primary Antibody Epithelial Staining
Multiskan Go plate reader	Thermo Fisher	51119300	Technical equipment
Normal donkey serum	Biozol	LIN-END9010-10	Chemicals
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome	Fluorescence Microscope Setup
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122	Cell culture consumables
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56	Microfluidic consumables
Polyclonal, goat, anti-human VE-Cadherin Antibody	R&D Systems	AF938	Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human Von Willebrand Factor Antibody	Dako	A0082	Primary Antibody Vascular Staining
Polyclonal, rabbit, anti-human ZO-1 antibody	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	61-7300	Primary Antibody Epithelial Staining
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232	Fluorescence Microscope Setup
Primovert microscope	Zeiss	415510-1101-000	Technical equipment
Reglo ICC peristaltic pump	Ismatec	ISM4412	Technical equipment
SAHA (Vorinostat)	Sigma Aldrich	SML0061-25MG	Chemicals
Saponin	Fluka	47036	Chemicals
S-Monovette, 7.5 mL Z-Gel	Sarstedt	01.1602	Consumables
S-Monovette, 9.0 mL K3E	Sarstedt	02.1066.001	Consumables
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-088	Cell culture consumables
Tank 4.5 mL	ChipShop	10000079	Microfluidic consumables
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	Cell culture consumables
Trypsin	Gibco	11538876	Cell culture consumables
Tubing	Dynamic 42	ST001	Microfluidic consumables
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1	Consumables
Wheat Germ Agglutinin (WGA)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	W32464	Epithelial Staining
X-VIVO 15	Lonza	BE02-060F	Cell culture consumables, Hematopoietic cell medium
Zellkultur Multiwell Platten, 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160	Consumables
Zellkultur Multiwell Platten, 6 Well, sterile	Greiner Bio-One	657 160	Consumables
Zen Blue Software	Zeiss	Version 3.7	Microscopy Software