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Un modèle photopolymérisable d’acide hyaluronique-collagène du microenvironnement invasif du gliome avec flux interstitiel
Dans cet article
Résumé
Nous présentons une méthode de réplication du microenvironnement tumoral du gliome sur le front invasif qui intègre le flux de liquide interstitiel. Ce modèle est un hydrogel hyaluronane-collagène I dans un insert de culture tissulaire où une tête de pression de fluide peut être appliquée. L’invasion peut être quantifiée et les cellules peuvent être isolées ou lysées.
Résumé
La récidive du glioblastome est un obstacle majeur au succès du traitement et est due à l’invasion de cellules souches de gliome (CSG) dans les tissus sains qui sont inaccessibles à la résection chirurgicale et résistent aux chimiothérapies existantes. Le mouvement du fluide au niveau des tissus, ou écoulement de fluide interstitiel (IFF), régule l’invasion de la GSC d’une manière dépendante du microenvironnement tumoral (TME), soulignant la nécessité de systèmes modèles qui intègrent à la fois l’IFF et le TME. Nous présentons une méthode accessible pour reproduire l’EUT invasif dans le glioblastome : un hydrogel hyaluronane-collagène I composé de CSG humaines, d’astrocytes et de microglies ensemencées dans un insert de culture tissulaire. Un IFF élevé peut être représenté par l’application d’une tête de pression de fluide sur l’hydrogel. De plus, ce modèle peut être réglé pour reproduire les différences inter ou intra-patients dans les rapports cellulaires, les débits ou les rigidités matricielles. L’invasion peut être quantifiée, tandis que les gels peuvent être récoltés pour divers résultats, notamment l’invasion de la GSC, la cytométrie en flux, l’extraction de protéines ou d’ARN ou l’imagerie.
Introduction
Le glioblastome est une maladie dévastatrice, caractérisée par une courte survie1 qui n’est prolongée que modérément par les traitements cliniquement disponibles 2,3. Cet obstacle à un traitement efficace est en grande partie dû à la nature hautement infiltrante des cellules souches de gliome chimiorésistantes (CSG) qui sont inaccessibles à la résection et à l’ensemencement de tumeurs récurrentes4. Parallèlement, les GSC sont très plastiques, répondant à divers stimuli dans le microenvironnement tumoral (TME) afin de survivre et ....
Protocole
Ce protocole a été élaboré conformément aux directives établies par le comité institutionnel de biosécurité de Virginia Tech.
REMARQUE : Effectuez toutes les procédures dans une armoire de culture cellulaire BSL-2, sauf indication contraire. Veuillez consulter le comité de biosécurité de l’établissement pour obtenir des conseils sur l’utilisation des cellules humaines.
1. Calculs pour la préparation du gel
- Calculez le nombre de conditions nécessaires à l’expérience.
REMARQUE : Une « condition » est définie par le contenu de la solution (par exemple, ....
Résultats Représentatifs
Des données représentatives de l’invasion (figure 3), de la viabilité et de l’expression de Ki67 et CD71 par cytométrie en flux (figure 4) sont fournies pour les lignées GSC publiées précédemment pour un hydrogel d’hyaluronane et de collagène12 modifié par des thio. La présence d’astrocytes et de microglies dans le modèle TME a un effet différentiel sur l’invasion de la GSC en fonct.......
Discussion
L’assemblage du modèle TME comprend six étapes fondamentales : 1) le passage des cellules et la séparation des cellules entre des conditions similaires, 2) l’assemblage d’une solution concentrée de collagène pour toutes les conditions, 3) la combinaison des composants du gel (cellules, collagène, acide hyaluronique méthacrylé et photo-initiateur) pour chaque condition 4) le placage des gels, 5) la réticulation par exposition aux UV et à la chaleur, et 6) l’ajout de la t.......
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts pertinent à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à remercier les sources de financement de ce travail : le National Institutes of Health National Cancer Institute (R37 CA222563 à J.M.), la Fondation Coulter (J.M.) et Virginia Tech ICTAS-CEH (J.M. & J.H.). Les GSC utilisées dans ce test ont été dérivées par Jakub Godlewski, Ph.D. (Harvard Medical School).
....matériels
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 Well Tissue Culture Plate, Sterile | Celltreat Scientific Products | 229112 | |
| 250 mL Filter System, PES Filter Material, 0.22 µm, 50 mm, Sterile | DOT Scientific | 667706 | |
| 385 nm, 1650 mW (Min) Mounted LED, 1700 mA | Thorlabs | M385LP1-C1 | |
| 75cm2 Tissue Culture Flask - Vent Cap, Sterile | Celltreat Scientific Products | 229341 | |
| 8.0 μm Cell Culture Plate Insert 12 mm Diameter | Millicell | PI8P01250 | |
| Absolute Ethanol, 200 proof, Molecular Biology Grade | Thermo Fisher Scientific | T038181000CS | Ethanol for flow cytometry dead cell control. |
| Astrocyte Medium (Astrofull) | ScienCell Research Laboratories | 1801 | Contains astrobasal, FBS, and penicillin/streptomycin. |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BSA (MACS) | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD71 antibody (eBioscience, Invitrogen) | Fisher Scientific | 25-0719-41 | |
| Cell Counting Chambered Slides | Nexcelom Bioscience | CHT4-PD100-002 | |
| Cell Scrapers | Biologix USA | 70-1250 | |
| Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter (Nexelcom Bioscience) | VWR | NEXCCMK2-SK150-FCS | |
| Centrifuge - Low-Speed | Eppendorf | 5702 R | Centrifuge for cell culture. |
| Clear Polystyrene 96-Well Microplates, Corning | Fisher Scientific | 07-200-108 | V-bottom plates for flow cytometry staining. |
| CO2 Incubator, 150L, Heracell 150i (Thermo Scientific) | Thermo Fisher Scientific | 50116047 | |
| Collagen I, High Concentration, Rat Tail | Corning | 354249 | |
| Collagen I, Rat Tail | Corning | 354236 | "Low" concentration for coating adherent flasks. |
| Collagenase (CAS# 9001-12-1) | United States Biological | C7511-30 | |
| Collimation Adapter for Olympus BX & IX, AR Coating: 350 - 700 nm | Thorlabs | COP1-A | |
| Cotton Swabs, Q-tips Precision Tips | Amazon | B01KCJB3R2 | |
| Dispase (CAS# 9001-92-7) | United States Biological | D3760 | |
| DMEM, high glucose (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
| EVOS FL | Invitrogen | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | For microglia culture. |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% (Sigma-Aldrich) | Millipore Sigma | HT501128 | |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | 00-5523-00 | |
| Glioma stem cells | n/a | n/a | Can be patient derived or commercial glioma stem cell lines. |
| Guava easyCyte HT System | Millipore Sigma | 0500-4008 | Flow cytometer. |
| HBSS (Sigma-Aldrich) | Millipore Sigma | H6648 | |
| HEPES (1 M) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| High-Power 1-Channel LED Driver with Pulse Modulation, 10.0 A Max, 50.0 V Max | Thorlabs | DC2200 | Interface for UV Lamp. |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) (Thermo Scientific) | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| Human Astrocytes | ScienCell Research Laboratories | 1800 | Primary astrocytes derived from the cerebral cortex. |
| Human EGF Recombinant Protein (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (aa 10-155) Recombinant Protein (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | PHG0021 | |
| Immortalized Human Microglia - hTERT | Applied Biological Materials | T0251 | |
| Incu-mixer MP Heated Microplate Vortexer, 2 position | Benchmark Scientific | H6002 | |
| Ki67 REAfinity, PerCP-Vio 700 antibody | Miltenyi Biotec | 130-120-420 | |
| LED UV Curing Meter | Gigahertz-Optik | X1-RCH-116 | Optometer to measure UV light intensity. |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Advanced Biomatrix | 5269-100MG | Photoinitiator. |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | L24975 | |
| Methacrylated hyaluronic acid (photoHA) | Advanced Biomatrix | 5212-100MG | |
| Microcentrifuge, Sorvall ST8R (Thermo Scientific) | Fisher Scientific | 75-997-203 | Centrifuge for flow cytometry staining. |
| N-2 Supplement (100X) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Neurobasal-A Medium (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10888022 | |
| PBS (10X), pH 7.4 without Ca & Mg | Quality Biological | 119-069-101 | |
| Sodium hydroxide, pellets ACS (CAS# 1310-73-2) | VWR | 97064-476 | |
| Synergy Ultrapure Water Purification System (MilliporeSigma) | Fisher Scientific | SYNS0HFUS | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| ViaStain AOPI Staining Solution | Nexcelom Bioscience | CS2-0106 |
Références
- Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2016-2020. Neuro Oncol. 25, 1-99 (2023).
- Stupp, R., et al.
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