Révéler le phénotype ferroptotique du médulloblastome

Résumé

La teneur en hydroperoxyde lipidique représente l’indicateur le plus couramment utilisé de la mort cellulaire ferroptotique. Cet article présente l’analyse par cytométrie en flux étape par étape de la teneur en hydroperoxyde lipidique dans les cellules lors de l’induction de la ferroptose.

Résumé

L’interaction du fer et de l’oxygène fait partie intégrante du développement de la vie sur Terre. Néanmoins, cette chimie unique continue de fasciner et d’intriguer, conduisant à de nouvelles entreprises biologiques. En 2012, un groupe de l’Université Columbia a reconnu que cette interaction était un événement central menant à un nouveau type de mort cellulaire régulée appelée « ferroptose ». La principale caractéristique de la ferroptose est l’accumulation d’hydroperoxydes lipidiques due à (1) une défense antioxydante dysfonctionnelle et/ou (2) un stress oxydatif écrasant, qui coïncide le plus souvent avec une teneur accrue en fer labile libre dans la cellule. Ceci est normalement empêché par l’axe canonique anti-ferroptotique comprenant le transporteur de cystine xCT, le glutathion (GSH) et la GSH peroxydase 4 (GPx4). La ferroptose n’étant pas un type programmé de mort cellulaire, elle n’implique pas de voies de signalisation caractéristiques de l’apoptose. La façon la plus courante de prouver ce type de mort cellulaire est d’utiliser des antioxydants lipophiles (vitamine E, ferrostatine-1, etc.) pour la prévenir. Ces molécules peuvent approcher et détoxifier les dommages oxydatifs dans la membrane plasmique. Un autre aspect important dans la mise en évidence du phénotype ferroptotique est la détection de l’accumulation préalable d’hydroperoxydes lipidiques, pour lesquels le colorant spécifique BODIPY C11 est utilisé. Le présent manuscrit montrera comment la ferroptose peut être induite dans les cellules de médulloblastome de type sauvage en utilisant différents inducteurs : l’ératine, la RSL3 et le donneur de fer. De même, les cellules xCT-KO qui se développent en présence de NAC et qui subissent une ferroptose une fois que la NAC est retirée seront utilisées. Le phénotype caractéristique « bouillonnant » est visible au microscope optique dans les 12 à 16 heures suivant le déclenchement de la ferroptose. De plus, une coloration BODIPY C11 suivie d’une analyse FACS pour montrer l’accumulation d’hydroperoxydes lipidiques et la mort cellulaire subséquente à l’aide de la méthode de coloration PI sera utilisée. Pour prouver la nature ferroptotique de la mort cellulaire, la ferrostatine-1 sera utilisée comme agent spécifique de prévention de la ferroptose.

Introduction

La ferroptose est un type^{de mort cellulaire} 1 dépendant des espèces réactives de l’oxygène (ROS) nouvellement contextualisé. Outre les ROS, le fer joue un rôle crucial dans ce type de mort cellulaire, d’où le nom². L’étape finale et exécutive de la ferroptose est l’accumulation catalysée par le fer de dommages oxydatifs des lipides dans la membrane plasmique qui conduit finalement à une compromission de l’intégrité de la membrane et à une perméabilité sélective, et, enfin, à la mort cellulaire par bouillonnement. L’hydroperoxydation des lipides est un phénomène naturel ; Cependant, sa propagation dans toute la membrane cellulaire est empêchée par la défense antioxydante de la cellule. L’acteur majeur dans ce contexte est la protéine Sè glutathion peroxydase 4 (GPx4), qui peut s’approcher de la membrane et convertir les hydroperoxydes lipidiques en leurs dérivés alcooliques moins toxiques³. Le pouvoir réducteur de GPx4 est principalement, mais pas exclusivement, fourni par le glutathion (GSH), un tripeptide composé des acides aminés non essentiels : glycine, glutamate et cystéine. L’acide aminé limitant le taux de biosynthèse du GSH est la cystéine⁴. Bien que la cystéine soit classée comme un acide aminé non essentiel, ses besoins peuvent facilement dépasser sa production interne dans les cellules hautement prolifératives (telles que les cellules cancéreuses). Il a donc été reclassé dans le groupe des acides aminés semi-essentiels. L’importation nécessaire de cystéine se produit principalement par le biais du système Xc-, qui permet l’importation de la forme oxydée (dominante) de la cystéine (alias cystine) au détriment de l’exportation de glutamate⁵. Le système Xc- est composé d’une sous-unité de transport indépendante du Na+ et dépendante de Cl, connue sous le nom de xCT, et d’une sous-unité chaperonne, connue sous le nom de CD98. Jusqu’à récemment, les propriétés anti-ferroptotiques de l’axe xCT-GSH-GPx4 étaient considérées comme uniques et irréplicables⁶. Cependant, en 2019, une voie alternative anti-ferroptotique, composée d’ubiquinol (coenzyme Q10) et de son enzyme régénérative - la protéine suppressive de ferroptose 1 (FSP1), a été décrite ^7,8. Peu de temps après, un autre système de détoxification à base d’hydroperoxyde lipidique impliquant la GTP cyclohydrolase-1/tétrahydrobioptérine (GCH1/BH4) a été signalé⁹. Néanmoins, le rôle central de l’axe xCT-GSH-GPx4 dans la prévention de la ferroptose ne semble pas être remis en question.

Au cours de la dernière décennie, la ferroptose a été largement étudiée dans une variété de types de tumeurs, montrant un grand potentiel en tant que stratégie anticancéreuse (examiné par Lei et ^al.10). De plus, il a été rapporté que les cellules cancéreuses présentant une résistance élevée aux chimiothérapies conventionnelles et/ou une propension à métastaser sont étonnamment sensibles aux inducteurs de ferroptose, tels que les inhibiteurs de GPx4 11,12,13. Cependant, dans le contexte des tumeurs cérébrales, le potentiel des inducteurs ferroptotiques reste largement sous-étudié. Bien que ce type de mort cellulaire ait été étroitement associé aux lésions d’ischémie-reperfusion cérébrale¹⁴et aux maladies neurodégénératives¹⁵, son potentiel dans le contexte des tumeurs cérébrales a principalement été limité au glioblastome, la tumeur craniocérébrale maligne la plus courante (examiné par Zhuo et ^al.16). D’autre part, la sensibilité du médulloblastome, la tumeur cérébrale maligne pédiatrique la plus courante et l’une des principales causes de mortalité infantile, aux inducteurs de ferroptose reste largement inexplorée. À notre connaissance, il existe peu de littérature évaluée par des pairs établissant un lien entre la ferroptose et le médulloblastome. Néanmoins, certaines études ont révélé que le fer joue un rôle crucial dans la survie, la prolifération et le potentiel tumorigène des cellules souches cancéreuses du médulloblastome et du glioblastome (CSC)^17,18, ce qui les rend potentiellement plus vulnérables à l’induction de la ferroptose. Ceci est particulièrement important car le médulloblastome est connu pour sa sous-population de CSC, ou cellules initiatrices/propagatrices de tumeurs, qui semblent être en grande partie responsables de la chimiorésistance, de la dissémination et de la rechute des tumeurs¹⁹.

La sensibilité à l’induction de la ferroptose est généralement étudiée en mesurant la teneur/l’accumulation d’hydroperoxyde lipidique, qui peut ou non conduire à la mort cellulaire. Les inducteurs de ferroptose les plus couramment utilisés sont (1) l’ératine, un inhibiteur du transporteur xCT²⁰, (2) RSL3, un inhibiteur de l’enzyme GPx4², et/ou (3) les donneurs de fer, tels que le citrate de ferro-ammonium (FAC)²¹. La teneur en hydroperoxyde lipidique est évaluée à l’aide de la sonde sélective BODIPY 581/591 C11²², qui a des maxima d’excitation et d’émission à 581/591 nm à l’état réduit. Lors de l’interaction et de l’oxydation par les hydroperoxydes lipidiques, la sonde décale ses maxima d’excitation et d’émission à 488/510 nm. En règle générale, une augmentation significative de la teneur en hydroperoxyde lipidique précède la mort cellulaire ferroptotique. Comme la ferroptose n’est pas une mort cellulaire programmée, il n’y a pas de cascade de signalisation moléculaire menant à son exécution. Par conséquent, la seule façon de le confirmer est de surveiller la teneur en hydroperoxyde lipidique et d’utiliser des inhibiteurs spécifiques de ce type de mort cellulaire, tels que la ferrostatine 1²³. La ferrostatine 1 est un antioxydant lipophile qui peut pénétrer dans le compartiment lipidique de la cellule et détoxifier les hydroperoxydes lipidiques, prévenant ainsi les événements ferroptotiques.

Protocole

La présente étude a été menée à l’aide de lignées cellulaires de médulloblastome de type sauvage (WT) DAOY, qui ont été cultivées à 37 °C avec 5 % de CO₂ dans un milieu DMEM complété par 8 % de FBS. La lignée cellulaire délétée xCT a été maintenue dans les mêmes conditions, avec des expériences réalisées dans des milieux complétés par 1 mM de N-acétylcystéine (NAC). Les cellules ont été régulièrement dépistées pour les mycoplasmes à l’aide d’un kit de détection de mycoplasmes disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) et ont été cultivées jusqu’au 10^e passage.

1. Récolte et ensemencement des cellules

REMARQUE : Toutes les étapes sont effectuées à l’aide de techniques aseptiques stériles dans une hotte à flux laminaire de culture tissulaire. Les cellules du médulloblastome DAOY sont adhérentes, ce qui signifie que toutes les cellules non attachées peuvent être éliminées par lavage avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans Ca²⁺ et Mg²⁺.

1. Prenez la boîte de Pétri (boîte de Pétri de 100 mm de diamètre) avec les cellules et retirez les cellules flottantes et le milieu de la plaque à l’aide d’un aspirateur.
2. Ajoutez 5 à 10 ml de PBS dans le plat, lavez le fond en effectuant des mouvements circulaires du plat, puis retirez le PBS de l’assiette à l’aide d’un aspirateur.
3. Ajouter 1 mL de trypsine (dilution 10x) dans le plat. Incuber la plaque jusqu’à ce qu’un léger tapotement de la plaque déloge les cellules. Prenez 10 ml de milieu de culture DMEM complété par 8% de FBS et récoltez mécaniquement les cellules de la boîte.
4. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml.
5. Prélever 500 μL de suspension cellulaire et les mettre dans une cuvette pour le comptage. Comptez le nombre de cellules par mL de suspension cellulaire. Un compteur cellulaire automatisé a été utilisé pour cette étude (voir la Table des matières).
6. Calculez le volume nécessaire à prélever de la suspension cellulaire pour avoir 1,00,000 cellules.
7. Prenez une plaque à 6 puits et ajoutez le volume calculé de la suspension cellulaire dans chaque puits, puis ajoutez du milieu de culture DMEM complété par 8 % de FBS à 2 mL dans chaque puits.

2. Traitement des cellules

REMARQUE : Le contrôle et les traitements sont effectués en trois exemplaires. Les groupes sont les suivants : Contrôle (DMSO), 1 μM d’érestine, 0,3 μM de RSL3, 250 μM de FAC, 2 μM de Ferrostatine 1, 1 μM d’érastine + 2 μM de Ferrostatine 1, 0,3 de μM RSL3 + 2 μM de Ferrostatine 1, 250 μM de FAC + 2 μM de Ferrostatine 1. Quatre plaques à 6 puits sont nécessaires pour l’expérience, comme indiqué dans le tableau 1). Les détails commerciaux de tous les réactifs nécessaires sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. 24 h après l’ensemencement, ajoutez le traitement correspondant dans le puits avec les cellules.
2. Laissez les plats à 37 °C et 5% de CO₂ dans l’incubateur.

3. Coloration aux hydroperoxydes lipidiques des cellules traitées avec la sonde BODIPY 581/591 C11

REMARQUE : La solution mère de la sonde spécifique de l’hydroperoxyde lipidique est préparée dans du DMSO à une concentration de 1 mM. Les aliquotes de la solution mère sont stockées à -20 °C dans des tubes non transparents. Pour la coloration, préparer une solution de travail de 2 μM de la sonde dans un milieu DMEM complétée par 8 % de FBS.

1. 6 h après le traitement, observez les cellules au microscope optique (l’arrondi des cellules doit être visible).
2. Retirez les plats de l’incubateur et placez-les dans une hotte à flux laminaire de culture tissulaire.
   À l’aide d’un aspirateur, retirez le média et les cellules flottantes (mortes).
3. Ajoutez délicatement 2 ml de PBS dans chaque puits, lavez le fond avec des mouvements circulaires des plaques à 6 puits, puis retirez le PBS des puits à l’aide d’un aspirateur.
4. Ajouter 2 mL de la solution de travail de la sonde (concentration finale de 2 μM dans le DMEM complétée par du FBS).
5. Laissez le plat dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO₂ pendant 30 min dans l’obscurité (les assiettes peuvent être enveloppées dans du papier d’aluminium).

4. Analyse par cytométrie en flux de la teneur en hydroperoxyde lipidique dans les cellules traitées

REMARQUE : Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans l’obscurité (pas de lumières dans la hotte à flux laminaire).

1. Sortez les plats de l’incubateur et placez-les dans une hotte à flux laminaire de culture tissulaire.
   À l’aide d’un aspirateur, retirez la solution de coloration.
2. Ajoutez délicatement 2 ml de PBS dans chaque puits, lavez le fond avec des mouvements circulaires des plaques à 6 puits, puis retirez le PBS des puits à l’aide d’un aspirateur.
3. Répétez l’étape de lavage une fois de plus et aspirez tout PBS restant du puits à l’aide d’un aspirateur.
4. Ajouter 150 μL d’un réactif de dissociation cellulaire disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) au fond de chaque puits et incuber la plaque jusqu’à ce qu’un léger tapotement de la plaque déloge les cellules. Prélever 250 μL de tampon FACS (PBS, 2 mM EDTA, 0,5 % BSA) et prélever mécaniquement les cellules des puits.
5. Transférez les cellules dans le tube FACS correspondant (préalablement marqué) avec le capuchon du filtre. Placez le tube avec les cellules sur de la glace dans l’obscurité jusqu’à ce que l’analyse soit effectuée (l’analyse doit être effectuée dans l’heure suivant la coloration).
   REMARQUE : La configuration et l’étalonnage de la machine FACS dépendent de la machine utilisée (voir le tableau des matériaux).
6. Créez une nouvelle expérience et donnez-lui un nom (Ferroptose dans DAOY - hydroperoxydes lipidiques).
7. Dans le plan d’expérience, choisissez le laser (488 nm) et le filtre (FITC).
8. Dans les données de vue, sélectionnez la taille de cellule appropriée (>12 μm), réglez les tensions PMT (la population de cellules doit apparaître dans le premier quadrant du graphique à points SSC-H/FSC-H) et contrôlez le graphique à points.
9. Ajoutez un nouveau graphique - histogramme, avec FITC-A sur l’axe des y et l’échelle logarithmique.
10. Vortex les échantillons dans le tube FACS, placez-les dans la machine FACS et chargez l’échantillon. Enregistrez 10 000 événements de singulet FSC et nommez le fichier (par exemple, DAOY WT CTL 6h). Exportez le fichier au format .fcs.

5. Coloration à l’iodure de propidium (PI) des cellules mortes lors du traitement

REMARQUE : La conception de l’expérience est exactement la même que pour la mesure de l’hydroperoxyde lipidique (voir l’étape 1 et l’étape 2).

1. 24 h après l’ensemencement, sortez les plats de l’incubateur et placez-les dans la hotte à flux laminaire.
2. Prélever le milieu (avec les cellules mortes) dans un tube de 15 mL.
3. Ajoutez 1 ml de PBS dans chaque puits, lavez le fond avec des mouvements circulaires des plaques à 6 puits, puis recueillez le PBS dans le tube avec le milieu respectif.
4. Ajouter 200 μL de trypsine (dilution 10x) au fond de chaque puits et incuber la plaque jusqu’à ce qu’un léger tapotement de la plaque déloge les cellules. Utilisez le milieu respectif + PBS pour récolter les cellules des puits.
5. Centrifuger la suspension cellulaire à 180 x g pendant 10 min à température ambiante. Retirez le surnageant à l’aide d’un aspirateur.
6. Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 300 μL de tampon FACS et la placer sur de la glace jusqu’à l’analyse.
7. Juste avant l’analyse, ajouter la solution d’IP (voir le tableau des matériaux) à une concentration finale de 2 μg/mL.

6. Analyse par cytométrie en flux des cellules mortes 24h après le traitement

REMARQUE : Les réglages et l’étalonnage de la machine FACS sont effectués comme indiqué précédemment (voir étape 4).

1. Créez une nouvelle expérience et donnez-lui un nom (Ferroptose dans DAOY - mort cellulaire).
2. Dans le plan d’expérience, choisissez le laser (488 nm) et le filtre (PE).
3. Dans les données d’affichage, sélectionnez la taille de cellule appropriée (>12 μm), réglez les tensions PMT (la population de cellules doit apparaître dans le premier quadrant du graphique à points SSC-H/FSC-H) et contrôlez le graphique à points.
4. Ajoutez un nouveau tracé - histogramme, avec PE-A sur l’axe des y et l’échelle logarithmique.
5. Vortex les échantillons dans le tube FACS, placez-les dans la machine FACS et chargez l’échantillon.
6. Enregistrez 10 000 événements de singulet FSC et nommez le fichier (par exemple, DAOY WT CTL 6h). Exportez le fichier au format .fcs.

7. Analyse par cytométrie en flux de la teneur en hydroperoxyde lipidique dans les cellules DAOY xCT-/-

REMARQUE : les cellules xCT^-/- ont été générées comme décrit précédemment²⁴.

1. Pour cette expérience, ensemencez les cellules comme indiqué à l’étape 2, mais au lieu du traitement, complétez le milieu avec 1 mM de NAC pendant la nuit.
2. Le lendemain, conservez NAC dans un groupe et retirez-le de l’autre.
3. Effectuez l’analyse par cytométrie en flux de la teneur en hydroperoxyde lipidique exactement de la même manière que celle décrite à l’étape 6.

8. Analyse des résultats du cytomètre en flux

1. Ouvrez le document .fcs dans le logiciel FlowJo (voir la Table des matériaux).
2. Double-cliquez sur le fichier individuel pour ouvrir tous les événements (pas seulement les singulets FCS) enregistrés dans l’échantillon individuel (diagramme à points SSC-A/FSC-A). Étant donné que les paramètres sont tels que le gate effectué sur la machine n’est pas conservé, il est nécessaire de refaire le gate et de nommer la population (par exemple, DAOY WT).
3. Double-cliquez sur la population fermée pour ouvrir une autre fenêtre avec l’histogramme.
4. Remplacez l’axe Y par le filtre fluorescent utilisé (Comp-FITC/PE-A).
5. Changez l’axe des X en modal (normalisez chaque pic à son mode, c’est-à-dire en % du nombre maximum de cellules trouvées dans un bac particulier).
6. Copiez l’histogramme dans l’éditeur de mise en page. Répétez cette opération pour tous les échantillons, et chaque fois qu’un nouvel histogramme est collé dans l’éditeur de mise en page, faites-le glisser sur le précédent afin que les histogrammes soient superposés (demi-décalage).

Résultats

La lignée cellulaire de médulloblastome DAOY a été cultivée dans un milieu DMEM standard complété par 8 % de FBS jusqu’à ce qu’elle atteigne environ 60 % de confluence. Le jour de l’expérience, les cellules ont été récoltées et 1 000 000 cellules par puits ont été plaquées dans des plaques à 6 puits, selon le tableau 1. Le lendemain, les cellules (en trois exemplaires) ont été traitées avec soit 1 μM d’érastine, 0,3 μM de RSL3 ou 250 μM de FAC. Les plaques ont ensuite ét?...

Discussion

La principale caractéristique de la mort cellulaire ferroptotique est l’accumulation incontrôlée d’hydroperoxydes lipidiques dans la membrane plasmique. Ces dommages oxydatifs peuvent se produire de manière enzymatique ou non enzymatique, mais dans les deux cas, la réaction est dépendante du fer/catalysée, d’où le nom de ce type de mort cellulaire. L’hydroperoxydation lipidique est souvent estimée indirectement en mesurant les produits de dégradation de l’hydroperoxydation lipidique, tels que le 4-hyd...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BODIPY 581/591 C11	Thermo Fisher	D3861
Cell counter	Beckman	Coulter Z1
DMEM medium	Gibco	10569010
Erastin	Sigma-Aldrich	E7781-5MG
Ferroamminium citrate	Acros Organics	211842500
Ferrostatin-1	Sigma-Aldrich	SML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)	Dominique Dutcher	500105N1N
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher	11599686
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit	InvivoGen	rep-pt1
propidium iodide	Invitrogen	P3566
RSL3	Sigma-Aldrich	SML2234-25MG
Trypsin - EDTA 10X - 100 mL	Dominique Dutcher	X0930-100