La levure de fission comme plate-forme pour le criblage de médicaments antibactériens ciblant les protéines du cytosquelette bactérien

Résumé

La levure de fission est utilisée ici comme hôte hétérologue pour exprimer des protéines cytosquelettiques bactériennes telles que FtsZ et MreB en tant que protéines de fusion translationnelle avec GFP pour visualiser leur polymérisation. De plus, les composés qui affectent la polymérisation sont identifiés par imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence.

Résumé

Les protéines cytosquelettiques bactériennes telles que FtsZ et MreB remplissent des fonctions essentielles telles que la division cellulaire et le maintien de la forme cellulaire. De plus, FtsZ et MreB sont apparus comme des cibles importantes pour la découverte de nouveaux antimicrobiens. Plusieurs tests ont été mis au point pour identifier des composés ciblant la liaison nucléotidique et la polymérisation de ces protéines cytosquelettiques, principalement axés sur FtsZ. De plus, de nombreux tests sont soit laborieux, soit coûteux et nécessitent souvent plusieurs méthodes pour déterminer si ces protéines sont la cible cellulaire du médicament. Enfin, la toxicité des médicaments pour les cellules eucaryotes pose également un problème. Ici, nous décrivons un test cellulaire en une seule étape pour découvrir de nouvelles molécules ciblant le cytosquelette bactérien et minimiser les coups qui pourraient être potentiellement toxiques pour les cellules eucaryotes. La levure de fission se prête aux cribles à haut débit basés sur la microscopie, et un écran visuel peut facilement identifier toute molécule qui modifie la polymérisation de FtsZ ou de MreB. Notre test utilise la plaque standard à 96 puits et repose sur la capacité des protéines cytosquelettiques bactériennes à polymériser dans une cellule eucaryote telle que la levure de fission. Bien que les protocoles décrits ici concernent les levures à fission et utilisent le FtsZ de Staphylococcus aureus et le MreB d’Escherichia coli, ils sont facilement adaptables à d’autres protéines cytosquelettiques bactériennes qui s’assemblent facilement en polymères chez n’importe quel hôte d’expression eucaryote. La méthode décrite ici devrait faciliter la découverte de nouveaux antimicrobiens ciblant les protéines cytosquelettiques bactériennes.

Introduction

La résistance généralisée à presque tous les antibiotiques actuellement utilisés pour lutter contre les infections bactériennes a créé un besoin immédiat de nouvelles catégories d’antibiotiques. Un rapport de 2019 a indiqué que les infections résistantes aux antibiotiques ont entraîné la perte de 1,27 million de vies, contribuant à un décompte global de 4,95 millions de décès si l’on considère les complications des infections bactériennes résistantes¹. Bien qu’il soit toujours efficace dans la pratique clinique, l’arsenal actuel d’antibiotiques cible principalement un spectre étroit de processus cellulaires, en se concentrant principalement sur la paroi cellulaire, l’ADN et la synthèse des protéines. Au cours du dernier demi-siècle, moins de 30 protéines ont été exploitées commercialement comme cibles pour le développement de nouveaux antibactériens ^2,3. Cette gamme limitée de cibles viables crée des contraintes significatives à la découverte de nouveaux antibiotiques ou de leurs dérivés pour lutter contre les bactéries résistantes aux antibiotiques. Ainsi, pour surmonter le problème émergent de la résistance aux antibiotiques, il est nécessaire de développer de nouveaux antibiotiques avec de nouvelles cibles et de nouveaux mécanismes d’action.

Une cible antibactérienne devrait idéalement être un composant essentiel de la croissance cellulaire bactérienne, être conservée dans toutes les espèces phylogénétiquement diverses, présenter une homologie eucaryote minimale et être accessible aux antibiotiques⁴. Depuis la découverte de protéines cytosquelettiques bactériennes impliquées dans la division cellulaire et le maintien de la forme cellulaire, elles sont devenues un point focal prometteur pour le développement de composés antibactériens⁵. Ces protéines sont essentielles à la viabilité bactérienne et jouent un rôle central dans le maintien de la forme cellulaire (MreB, CreS), de la division (FtsZ, FtsA) et de la ségrégation de l’ADN (ParM, TubZ, PhuZ, AlfA), semblable au cytosquelette dans les cellules eucaryotes. Notamment, FtsZ présente un niveau de conservation remarquablement élevé chez un large éventail d’organismes procaryotes, tandis que MreB se trouve dans presque toutes les bactéries en forme de bâtonnet. Une telle distribution et une telle pertinence dans la viabilité cellulaire font de ces protéines une cible fascinante dans la recherche sur les antibiotiques ^5,6,7.

Il est crucial d’adopter une approche à plusieurs volets qui combine des observations in vivo, des interactions in vitro et des expériences enzymatiques pour valider en profondeur les protéines du cytosquelette bactérien en tant que cible principale d’un inhibiteur potentiel⁷. Des procédures laborieuses ou des implications financières importantes alourdissent de nombreux tests disponibles à cette fin. Ce sont des obstacles notables à leur utilisation généralisée dans le criblage des composés principaux qui pourraient avoir un impact sur le cytosquelette bactérien. Parmi celles-ci, la microscopie se distingue par une méthode exceptionnellement efficace et rapide pour évaluer l’efficacité des composés en examinant directement les changements de morphologie cellulaire. Pourtant, l’hétéro-association de la protéine cible avec d’autres complexes du cytosquelette, les effets indirects dus à la liaison hors cible et aux modifications du potentiel membranaire, la difficulté à pénétrer efficacement dans la cellule et la présence de pompes d’efflux, en particulier chez les bactéries à Gram négatif, rendent collectivement complexe l’identification de la cause précise de la déformation cellulaire bactérienne ^8,9,10.

Schizosaccharomyces pombe, ou levure à fission comme on l’appelle communément, est un organisme eucaryote unicellulaire en forme de bâtonnet. La levure de fission est largement utilisée comme organisme modèle en biologie cellulaire et moléculaire en raison de la conservation extraordinaire des processus cellulaires tels que le cycle et la division cellulaires, l’organisation cellulaire et la réplication des chromosomes chez les eucaryotes supérieurs, y compris les humains^11,12. De plus, Errington et ses collègues ont exprimé une protéine cytosquelettique bactérienne localisée au pôle DivIVA dans la levure à fission pour démontrer que DivIVA s’accumulait sur des surfaces à courbure négative¹³. Encore une fois, Balasubramanian et son groupe ont d’abord établi la levure de fission comme système modèle cellulaire pour apporter de nouvelles connaissances sur le mécanisme, l’assemblage et la dynamique de la protéine du cytosquelette d’actine E. coli comme MreB¹⁴ et l’homologue de la tubuline FtsZ¹⁵. Ils démontrent également la capacité d’A22 à empêcher efficacement la polymérisation de MreB par microscopie à épifluorescence lorsqu’il est exprimé dans la levure¹⁴. Par la suite, d’autres groupes ont également utilisé avec succès des levures de fission pour étudier les propriétés d’assemblage des protéines FtsZ1 et FtsZ2¹⁶ du chloroplaste. Plus récemment, nous avons établi une preuve de concept de la viabilité de l’utilisation de la levure de fission comme plateforme cellulaire pour dépister spécifiquement les inhibiteurs du cytosquelette bactérien en effectuant une évaluation complète de l’impact de trois inhibiteurs connus de FtsZ - la sanguinarine, la berbérine et PC190723-- sur les protéines FtsZ dérivées de deux bactéries pathogènes, à savoir Staphylococcus aureus et Helicobacter pylori¹⁷. De plus, ce test cellulaire en une seule étape s’avère essentiel pour minimiser le risque d’identifier des composés potentiellement toxiques pour les cellules eucaryotes.

Dans ce rapport, en utilisant le système de levure à fission, nous proposons un flux de travail systématique utilisant la plaque standard à 96 puits pour le criblage semi-automatisé et la quantification de l’effet des inhibiteurs de petites molécules ciblant FtsZ de Staphylococcus aureus et MreB d’Escherichia coli. Ici, nous mettons en place et optimisons le flux de travail semi-automatisé à l’aide des inhibiteurs établis PC190723 et A22 qui ciblent spécifiquement FtsZ et MreB, respectivement. Ce flux de travail utilise un microscope à épifluorescence équipé d’une platine motorisée de haute précision et d’une acquisition d’image automatisée dans une plaque standard à 96 puits pour améliorer la normalisation actuelle. Par conséquent, il peut être appliqué à des cribles à moyen et à haut débit de bibliothèques chimiques synthétiques et contourne certains des défis énumérés ci-dessus.

Protocole

1. Expression des protéines du cytosquelette bactérien marquées à la GFP chez S. pombe

REMARQUE : Veuillez consulter le tableau 1 pour obtenir des renseignements sur tous les plasmides et souches utilisés ici. Veuillez consulter le tableau 2 pour toutes les compositions de supports.

1. Effectuer le clonage d’E. coli MreB avec une fusion GFP N-terminale (GFP-MreB) et de S. aureus FtsZ porteur d’une GFP C-terminale (SaFtsZ-GFP) dans le vecteur d’expression de S. pombe, pREP42 avec un promoteur répressible à la thiamine de force moyenne, nmt41^18,19 comme décrit précédemment^14,15. Maintenir, amplifier et isoler les plasmides des souches d’E. coli (DH10β) comme décrit en^20,21.
   REMARQUE : D’autres souches d’E. coli telles que DH5α, XL1Blue, TOP10, etc. ou d’autres cellules compétentes disponibles dans le commerce et couramment utilisées pour le clonage moléculaire peuvent également être utilisées.
2. Transformation des plasmides pREP42-GFP-EcMreB et pREP42-SaFtsZ-GFP en S. pombe
   1. Transformez les plasmides pCCD3 (pREP42-GFP-EcMreB) et pCCD713 (pREP42-SaFtsZ-GFP) en souche de S. pombe (^h-leu1-32 ura4-D18) en utilisant la méthode de l’acétate de lithium²², comme mentionné dans les étapes ci-dessous.
   2. Jour 1 - Culture primaire : Inculquer une boucle de culture de S. pombe fraîchement striée dans 3 mL de bouillon d’extrait et de suppléments de levure autoclavé (YES). Incubez-le dans un agitateur orbital à 30 °C pendant la nuit (O/N).
   3. Jour 2 :
      1. Culture secondaire : Ajouter environ 500 μL de culture primaire à 30 mL de bouillon YES autoclave. Incuber à 30 °C pendant 3 à 4 h en secouant jusqu’à ce que la DO₆₀₀ atteigne 0,4 à 0,6.
         REMARQUE : Pour chaque transformation, 30 mL sont utilisés.
      2. Granulez la culture de 30 mL à 2 500 x g pendant 6 à 8 min à température ambiante. Jeter le surnageant et laver les cellules avec 50 mL d’eau distillée stérile (D/W). Granulez à nouveau et jetez le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de D/W stérile et les transférer dans un tube à centrifuger de 2 mL. Centrifuger comme ci-dessus et jeter le surnageant.
      3. Ajouter 1 mL d’acétate de lithium 0,1 M, une solution de Tris-EDTA (LiAc-TE) et centrifuger comme ci-dessus. Jeter le surnageant et le remettre en suspension dans 1 mL de LiAc-TE 0,1 M. Centrifuger et jeter le surnageant, en laissant 100 μL de solution derrière eux.
      4. Ajoutez 10 à 20 g d’ADN porteur (ADN de spermatozoïde de saumon, dénaturé et refroidi par évaporation sur glace) et 2 à 3 g d’ADN plasmidique, qui doit être transformé. Mélangez délicatement. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
      5. Ajouter 260 μL de 40 % de PEG/LiAc-TE ; Mélangez doucement. Incuber pendant 60 min dans l’agitateur ou un thermomixeur à 30 °C avec un mélange doux. Ajouter 43 μL de DMSO ; Mélangez doucement.
      6. Choc thermique à 42 °C pendant 10 min dans le thermomixeur. Granuler à 2 500 x g pendant 6 à 8 min et jeter le surnageant. Lavez la pastille 1x avec 1 mL de D/W stérile.
      7. Granuler, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 200 μL de D/W stérile. Plaque de 100 μL sur des plaques de milieu minimal (EMM) d’Édimbourg contenant 5 μg/mL de thiamine (pour réprimer le promoteur nmt41 ) et des suppléments d’acides aminés adénine (0,225 mg/mL), d’histidine (0,225 mg/mL) et de leucine (0,225 mg/mL) mais manquant d’uracile (marqueur de sélection pour le plasmide pREP42).
         REMARQUE : Alternativement, les plaques 70 μL et 130 μL dans deux plaques différentes. Deux volumes différents (70 μL et 130 μL) sont plaqués pour obtenir des colonies isolées sur au moins une des plaques en fonction de l’efficacité de la transformation, qui peut varier d’une expérience à l’autre.
      8. Incuber les plaques à 30 °C pendant 2-3 jours jusqu’à l’apparition des colonies. Mélanger une seule colonie avec 100 μL de D/E stérile et étaler sur une plaque EMM fraîche contenant de la thiamine mais dépourvue d’uracile comme décrit ci-dessus.
      9. Incuber à 30 °C pendant 2-3 jours jusqu’à ce qu’une pelouse complète apparaisse. Grattez la pelouse cultivée des cellules à l’aide d’une boucle d’inoculation et mettez-la en suspension dans 1 mL de milieu YES contenant 30 % de glycérol dans un cryo-flacon.
      10. Congelez rapidement le cryo-flacon dans de l’azote liquide et conservez-le à -80 °C pour conserver les stocks de levures congelés.
3. Expression de protéines du cytosquelette bactérien dans la levure de fission
   1. Striez aseptiquement un patch du stock de glycérol sur une plaque fraîche spécifique à la levure pour obtenir une culture suffisante pour d’autres expériences.
      REMARQUE : Dans le cas de pREP42, nous avons utilisé une plaque de gélose EMM (milieu minimal) contenant de l’adénine, de l’histidine et de la leucine (comme avec la souche S. pombe (h-leu1-32 ura4-D18)) sans uracile (uracile présent dans pREP42 comme marqueur de sélection). Nous ajoutons 15 à 20 μM de thiamine aux plaques de gélose (car pREP42 a un promoteur nmt41 répressible de thiamine) pour réprimer l’expression du gène d’intérêt lors de la croissance sur la plaque.
   2. Inculquer une petite boucle de l’inoculum de la plaque striée dans 5 mL de milieu EMM spécifique à la levure dépourvu de thiamine et l’incuber pendant 10 à 12 h à 30 °C.
      REMARQUE : L’expression de FtsZ et de MreB de différentes espèces sous le promoteur nmt41 chez S. pombe peut varier, généralement de 16 à 30 h. Le moment optimal pour l’expression des protéines GFP-EcMreB et SaFtsZ-GFP chez S. pombe est de 20 à 24 h et de 16 à 20 h à 30 °C, respectivement, sans thiamine.

2. Traitement de cultures de S. pombe exprimant des protéines cytosquelettiques bactériennes marquées à la GFP

REMARQUE : Un certain nombre de molécules médicamenteuses différentes sont testées sur la culture de levure cultivée pendant la nuit dans une plaque de 96 puits.

1. Inoculez une culture fraîche en transférant 50 μL de la culture de nuit dans chaque puits d’une plaque à 96 puits contenant 150 μL de milieu EMM de levure fraîche à l’aide de l’instrument de pipetage multicanaux semi-automatisé à 96 puits.
2. Tout en pipetant à l’intérieur et à l’extérieur pour un mélange approprié à l’aide d’une pipette multicanaux semi-automatisée à 96 puits, introduisez lentement différentes concentrations croissantes de médicaments dans la culture en croissance, chacune effectuée en trois exemplaires, comme le montre le schéma de la figure 1.
3. Comme contrôle positif, utiliser les médicaments déjà connus, PC190723 pour (S. aureus FtsZ) et A22 (pour E. coli MreB) en double.
   REMARQUE : Comme indiqué précédemment, PC190723 et A22 ont été utilisés à une concentration de 56,2 μM¹⁷ et 72,6 μM ^14,17, respectivement. Pendant ce temps, le traitement A22 de SaFtsZ et le traitement PC190723 d’EcMreB ont servi de contrôles négatifs, respectivement.
4. Utilisez le DMSO comme contrôle des solvants à trois concentrations différentes selon les concentrations les plus basses et les plus élevées de médicaments.
   REMARQUE : Le solvant dans lequel les médicaments sont dissous est utilisé comme témoin de solvant.
5. Incuber les cultures témoins et traitées à 30 °C pendant 6 à 10 h (jusqu’à ce que les cellules montrent l’expression de protéines fluorescentes bactériennes), puis imager à l’aide de la microscopie à épifluorescence.

3. Visualisation des polymères

1. Appliquer une couche de 20 μL de concanavaline A à 1 mg/mL dans chaque puits de la plaque inférieure à 96 puits optiquement transparente (à paroi noire pour l’imagerie par fluorescence) et incuber pendant 20 min à température ambiante. Aspirez le liquide et laissez-le sécher à l’air libre pendant 10 min.
2. Transférez 20 μL de cellules de la plaque de culture dans chaque puits respectif et laissez reposer pendant 10 min. Lavez la cellule 3x-4x avec le milieu EMM stérile.
3. Une fois l’objectif à utiliser en place (voir étape 3.6), utilisez le mode navigateur dans le panneau d’acquisition du logiciel d’acquisition d’images pour l’alignement et la couverture des plaques à 96 puits. Alignez les bords du puits sur le navigateur.
4. Ensuite, sélectionnez les paramètres de couverture du puits, qui incluent une sélection multiposition de la région d’intérêt dans le puits, et utilisez le contrôle autofocus adaptatif avec le mode à la demande pour maintenir la mise au point sur l’échantillon pendant l’imagerie.
5. Acquérez des images à l’aide du contraste interférentiel différentiel (DIC) et de la fluorescence. Réglez des filtres d’excitation et d’émission de 475/28 nm et 525/48 nm, respectivement, pour imager les protéines bactériennes marquées à la GFP exprimées dans la levure. Obtenir des empilements Z à une taille de pas de 0,2 μm à travers l’épaisseur des cellules de levure (5 μm).
6. Capturez des images à l’aide d’un microscope à épifluorescence inversée équipé d’un objectif à immersion dans l’huile 100x, 1,4 NA et d’une caméra sCMOS 2 000 x 2 000 (taille de pixel de 6,5 μm x 6,5 μm). Utilisez un système d’éclairage LED pour l’excitation du fluorophore.
   REMARQUE : Tout système de microscope à épifluorescence doté d’une platine motorisée pour une plaque de 96 puits avec un positionnement multipoint précis devrait convenir. Acquérir toutes les images cellulaires du témoin et du médicament traité avec un temps d’exposition similaire (généralement de l’ordre de 0,3 à 0,5 s) à un binning de 1 x 1 et un éclairage à 15 % à 20 % afin de minimiser les variables de l’expérience et de maintenir l’uniformité.

4. Quantification des images à l’aide d’ImageJ

1. Traitez les images de cellules et mesurez le nombre de points par cellule et la densité pour FtsZ¹⁷. Dans le cas de MreB, mesurer la densité et l’anisotropie²³ et comparer entre les cellules témoins et les cellules traitées à l’aide de Fiji (v2.0.0-rc-69/1.52p)²⁴.
2. À l’aide des images du canal DIC, tracez d’abord le contour des cellules de levure individuelles à l’aide de l’outil de dessin à main levée et enregistrez-les en tant que région d’intérêt (ROI) dans le gestionnaire de ROI. Cette étape n’est pas encore automatisée, mais des outils récemment développés utilisant l’apprentissage automatique^25,26 pourraient être tentés et intégrés dans un avenir proche.
3. Masquez la zone extérieure de la cellule et remplissez en noir comme décrit à la^{section 27}.
4. Utilisez la macro d’analyse du seuil OPS IJ1, une fonctionnalité intégrée aux Fidji, pour compter le nombre de points²⁴.
5. Utilisez la méthode otsu pour le seuillage automatique et masquez les particules segmentées. Exécutez le plug-in pour analyser les particules à l’aide d’une macro.
6. Pour mesurer la densité des polymères (quantité de cytosquelette par unité de surface dans une cellule), traitez les images comme décrit, y compris les étapes^de masquage et de squelettisation ^27,28. Utilisez Lpx 2Dfilter dans le plug-in lpx pour squelettiser les images.
7. Pour plus de détails, consultez cette publication récente¹⁷. Effectuez la quantification du polymère EcMreB comme mentionné précédemment en²³, utilisez l’anisotropie pour quantifier l’organisation spatiale à l’aide de FibrilTool²⁹ comme décrit précédemment²³.
   REMARQUE : Ces méthodes d’analyse peuvent être utilisées pour quantifier toute autre protéine du cytosquelette bactérien qui est traitée ou non par les médicaments.

Résultats

Mise en place de la plaque à 96 puits pour le criblage des drogues
L’utilisation de S. pombe pour exprimer un S. aureus FtsZ marqué en C-terminal GFP à partir d’un vecteur (pREP42) contenant le promoteur répressible de thiamine de force moyenne nmt41a été précédemment établie¹⁷ et de même, le MreB d’E. coli marqué avec une GFP N-terminale a également été exprimé chez S. pombe¹⁴. Nous avons...

Discussion

La résistance aux antimicrobiens (RAM) est une grave menace pour la santé mondiale, et il existe un besoin urgent de nouveaux antibiotiques avec de nouvelles cibles. Le cytosquelette bactérien est apparu comme une cible attrayante pour le développement de nouveaux antibiotiques, avec des inhibiteurs de petites molécules de la protéine de division cellulaire FtsZ, tels que TXA709, déjà en essais cliniques de phase I³⁰. Plusieurs méthodes ont été développées pour identifier les inhibite...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well CC2 Optical CVG Sterile, w/Lid. Black	Thermo Scientific™	160376
96-well plate	Corning	CLS3370
A22 Hydrochloride	Sigma	SML0471	Dissolved in DMSO
Adenine	FormediumTM	DOC0229	225 mg/L of media
Concanavalin A	Sigma	C5275-5MG
DMSO	Sigma	317275
Edinburg minimal medium (EMM Agar or EMM Broth)	FormediumTM	PMD0210	See below for composition
EDTA	Sigma	EDS-500G
epMotion® 96 with 2-position slider	Eppendorf	5069000101
Histidine	FormediumTM	DOC0144	225 mg/L of media
Leica DMi8 inverted fluorescence microscope	Leica Microsystems		German company
Leucine	FormediumTM	DOC0157	225 mg/L of media
Lithium acetate	Sigma	517992-100G
PC190723	Merck	344580	Dissolved in DMSO
Polyethylene glycol (PEG)	Sigma	202398
Thiamine	Sigma	T4625	Filter sterilised
Tris-Hydrochloride	MP	194855
Uracil	FormediumTM	DOC0214	225 mg/L of media, Store solution at 36°C
YES (Yeast extract + supplements) Agar	FormediumTM	PCM0410	See below for composition
YES (Yeast extract + supplements) Broth	FormediumTM	PCM0310	See below for composition
Yeast (S. pombe) media
Yeast extract + supplements (YES)
	Composition	g/L
	Yeast extract	5
	Dextrose	30
	Agar	17
	Adenine	0.05
	L-Histidine	0.05
	L-Leucine	0.05
	L-Lysine HCl	0.05
	Uracil	0.05
Edinburg minimal medium (EMM)
	Composition	g/L	concentration
	potassium hydrogen phthallate	3	14.7mM
	Na2HPO4	2.2	15.5 mM
	NH4Cl	5	93.5 mM
	glucose	2% (w/v) or 20 g/L	111 mM
	Salts (stock x 50)	20 mL/L (v/v)
	Vitamins (stock x 1000)	1 mL/L (v/v)
	Minerals (Stock x 10,000)	0.1 mL/L (v/v)
Salts x 50	52.5 g/l MgCl2.6H20 (0.26 M)	52.5	0.26 M
	0.735 mg/l CaCl2.2H20 (4.99 mM)	0.000735	4.99 mM
	50 g/l KCl (0.67 M)	50	0.67 M
	2 g/l Na2SO4 (14.l mM)	2	14.1 mM
Vitamins x 1000	1 g/l pantothenic acid	1	4.20 mM
	10 g/l nicotinic acid	10	81.2 mM
	10 g/l inositol	10	55.5 mM
	10 mg/l biotin	0.01	40.8 µM
Minerals x 10,000	boric acid	5	80.9 mM
	MnSO4	4	23.7 mM
	ZnSO4.7H2O	4	13.9 mM
	FeCl2.6H2O	2	7.40 mM
	molybdic acid	0.4	2.47 mM
	KI	1	6.02 mM
	CuSO4.5H2O	0.4	1.60 mM
	citric acid	10	47.6 mM
Strains/ Plasmids
Strains	Description	Reference
CCD190	Escherichia coli DH10β	Invitrogen
CCDY4	MBY3532; CCDY346/pREP42- GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
CCDY340	CCDY346/pREP42- SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023
CCDY346	MBY192; Schizosaccharomyces pombe [ura4-D18, leu1-32, h-]	Dr. Mithilesh Mishra (DBS, TIFR)
Plasmids
pCCD3	pREP42-GFP-EcMreB	Srinivasan et al., 2007
pCCD713	pREP42-SaFtsZ-GFP	Sharma et al., 2023