Préparation et analyse de lames histologiques de globes oculaires de rat et de souris pour évaluer la rétine

Résumé

Ce manuscrit présente un protocole pour la préparation histologique de lames à partir de globes oculaires de rongeurs. Avec la méthode proposée, la rétine interne peut être facilement visualisée et évaluée au microscope optique. La procédure est présentée pour les globes oculaires des souris et des rats.

Résumé

Un globe oculaire de rongeur est un outil puissant pour étudier les mécanismes pathologiques de nombreuses maladies ophtalmiques, telles que le glaucome, la rétinopathie hypertensive et bien d’autres. Les expériences précliniques permettent aux chercheurs d’examiner l’efficacité de nouveaux médicaments, de développer de nouvelles méthodes de traitement ou de rechercher de nouveaux mécanismes pathologiques impliqués dans l’apparition ou la progression de la maladie. Un examen histologique fournit de nombreuses informations nécessaires pour évaluer les effets des expériences menées et peut révéler une dégénérescence, un remodelage tissulaire, une infiltration et de nombreuses autres pathologies. Dans la recherche clinique, il y a rarement une chance d’obtenir un tissu oculaire adapté à un examen histologique, c’est pourquoi les chercheurs devraient profiter de l’opportunité offerte par l’examen des globes oculaires des rongeurs. Ce manuscrit présente un protocole pour la préparation histologique des coupes oculaires de rongeurs. La procédure est présentée pour les globes oculaires de souris et de rats et comporte les étapes suivantes : (i) prélèvement du globe oculaire, (ii) conservation du globe oculaire pour une analyse plus approfondie, (iii) traitement du tissu en paraffine, (iv) préparation des lames, (v) coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, (vi) évaluation du tissu au microscope optique. Avec la méthode proposée, la rétine peut être facilement visualisée et évaluée en détail.

Introduction

Le globe oculaire est une structure en forme de globe constituant l’organe de la vue. L’intérieur du globe oculaire peut être divisé en deux segments : le segment antérieur, qui comprend la cornée, l’iris, le corps ciliaire, le cristallin, la chambre antérieure et la chambre postérieure, et le segment postérieur, qui comprend le corps vitré, la rétine, la choroïde, la sclère, la tête du nerf optique. La chambre antérieure est située entre la cornée et l’iris ^1,2. L’iris est une structure circulaire avec une ouverture au centre appelée la pupille. À la jonction de la cornée et de l’iris, il y a l’angle de drainage, où un système spécialisé de trabécules draine l’humeur aqueuse du globe oculaire au système veineux. La chambre postérieure est délimitée par l’iris, le corps ciliaire et le cristallin, ainsi que par les ligaments suspenseurs qui maintiennent le cristallin en place. Derrière le cristallin se trouve le corps vitré, qui est la plus grande structure du globe oculaire. Le corps vitré adhère à la rétine et stabilise sa position. La rétine est entourée par la choroïde et la sclérotique¹. L’anatomie du globe oculaire est résumée à la figure 1.

La paroi du globe oculaire se compose de trois couches. La couche la plus externe est la sclère, qui protège le globe oculaire des blessures et maintient sa forme. Au pôle antérieur du globe oculaire, la sclérotique se transforme en une cornée transparente. Sous la sclère, il y a une structure vasculaire appelée uvée, dont la fonction principale est de nourrir les structures de l’œil. L’uvée forme la choroïde, et à l’intérieur du pôle antérieur, le corps ciliaire et l’iris¹. La couche la plus interne est la rétine, qui est une structure hautement spécialisée de l’œil, composée de neurones, de cellules gliales et de cellules épithéliales pigmentaires. Les neurones rétiniens comprennent les cellules photoréceptrices (bâtonnets et cônes), les cellules horizontales, les cellules bipolaires, les cellules amacrines et les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR). Ces cellules sont organisées en couches complexes, et leur rôle est de recevoir et de traiter les stimuli lumineux ^2,3. Les cellules gliales de la rétine comprennent les cellules de Müller, les astrocytes et la microglie, qui sont présentes dans toutes les couches de la rétine. Les nombreuses fonctions des cellules gliales comprennent la nutrition des neurones, le soutien de la barrière hémato-rétinienne, le soutien structurel des neurones pour maintenir la structure en couches de la rétine, la régulation du métabolisme des neurones, la sécrétion de protéines biologiquement actives régulant le fonctionnement, la croissance et la survie des neurones, et la régulation des processus immunologiques au sein de la rétine⁴. Les cellules épithéliales pigmentaires constituent la couche la plus externe de la rétine et agissent comme une barrière entre la choroïde et les photorécepteurs. Ces cellules régulent le transport bidirectionnel des déchets et des nutriments et protègent également la rétine des dommages excessifs induits par la lumière en absorbant l’énergie lumineuse et en neutralisant les espèces réactives de l’oxygène générées par la lumière⁵.

La rétine peut être divisée en dix couches : (i) l’épithélium pigmentaire rétinien, (ii) la couche du segment photorécepteur (bâtonnets et cônes), (iii) la membrane limitante externe (ELM), (iv) la couche nucléaire externe (ONL), (v) la couche plexiforme externe (OPL), (vi) la couche nucléaire interne (INL), (vii) la couche plexiforme interne (IPL), (viii) la couche de cellules ganglionnaires (GCL), (ix) la couche de fibres nerveuses rétiniennes (RNFL), et (x) membrane limitative interne (ILM)². Les couches nucléées de la rétine comprennent l’ONL, l’INL et le GCL, tandis que les couches avec des connexions synaptiques entre les cellules comprennent l’OPL et l’IPL⁶. Les noyaux des bâtonnets et des cônes forment l’ONL, et leurs axones s’étendent dans l’OPL, où ils se connectent aux dendrites des cellules bipolaires et horizontales. À l’intérieur de l’INL, les noyaux cellulaires horizontaux, bipolaires et amacrines sont situés. Au sein de l’IPL, les terminaisons axonales des cellules bipolaires et amacrines font synapse avec les dendrites des CGR. Au sein du GCL, les CGR constituent la plupart des corps cellulaires, mais on peut également y trouver des cellules amacrines disloquées. Les axones des CGR forment le RNFL et, plus loin, le nerf optique ^7,8,9.

De nombreuses maladies ophtalmiques, telles que les troubles neurodégénératifs de la rétine, entraînent une cécité irréversible et incurable¹⁰. La vision est considérée comme l’un des sens les plus importants¹¹, et la cécité permanente réduit considérablement la qualité de vie du patient. Pour approfondir la compréhension des mécanismes pathologiques de nombreuses maladies, la recherche préclinique utilisant des cultures cellulaires ou des modèles animaux est largement réalisée. Les études précliniques sur des animaux de laboratoire sont l’occasion d’évaluer les mécanismes pathologiques sous-jacents aux maladies oculaires et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les maladies oculaires peuvent être modélisées à la fois chez les grands animaux (singes, vaches, chiens et chats) et les petits animaux (lapins, rats, souris et poissons-zèbres). L’utilisation d’animaux plus grands permet un meilleur accès à l’œil en raison de sa taille. Les expériences réalisées sur des rongeurs, en revanche, en raison de leur reproduction relativement rapide, permettent la reproduction de souches consanguines caractérisées par une sensibilité à certaines maladies^12,13.

Dans les modèles animaux, l’énucléation est possible, ce qui permet d’effectuer un examen histopathologique détaillé du globe oculaire, avec l’évaluation des pathologies mineures qui apparaissent dans des structures particulières de l’œil au cours du développement de la maladie - un examen qui peut être très rarement effectué chez l’homme. L’évaluation histopathologique est un outil extrêmement précieux dans la recherche des mécanismes pathologiques des troubles oculaires. Dans la littérature publiée, les descriptions de la méthodologie d’examen histologique des globes oculaires sont très limitées et les guides étape par étape manquent, ce qui rend difficile la recréation pour les débutants. Cette étude vise à fournir une méthode simple et concise de préparation de lames histologiques et d’évaluation de la rétine du rat et de la souris.

Protocole

La recherche a été réalisée dans le respect des directives institutionnelles. Les globes oculaires utilisés dans cette étude ont été obtenus à partir d’animaux inclus dans une expérience menée sur la base du numéro d’approbation de l’étude WAW2/122/2020 délivré par le 2^e comité d’éthique local de l’Université des sciences de la vie de Varsovie à Varsovie, en Pologne. Notre protocole a été élaboré en examinant des souris âgées de 11 et 44 semaines et des rats âgés de 6, 12 et 16 semaines.

1. Préparation des globes oculaires de souris

REMARQUE : Ce protocole présente la méthode de préparation de coupes de globes oculaires de souris et a été élaboré à l’aide de globes oculaires prélevés sur des souris femelles C57Bl/6 âgées de 11 semaines (poids moyen de 21 g), des souris femelles C57Bl/6 âgées de 44 semaines (poids moyen de 25 g), des souris DBA/2 femelles âgées de 11 semaines (poids moyen de 21,5 g) et des souris femelles DBA/2 âgées de 44 semaines atteintes de glaucome (poids moyen de 25 g).

1. Énucléation
   1. Utilisez de petites pinces pour ouvrir les paupières. Appuyez sur les paupières pour que le globe oculaire prolapsus.
   2. Disséquez le globe oculaire de l’orbite en coupant le tissu derrière le globe oculaire avec de petits ciseaux pointus. Une fois le globe oculaire retiré de l’orbite, coupez le tissu conjonctif saillant et les muscles périoculaires.
      1. Marquez les globes oculaires pour une meilleure orientation, par exemple, en attachant une petite suture sur le moignon du tendon du muscle droit latéral du globe oculaire pour marquer le côté temporal du globe oculaire.
2. Fixation des tissus
   1. Placez le globe oculaire énucléé dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et laissez-le reposer dans une solution à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dissous dans une solution saline tampon de phosphate (PBS) pendant 24 h.
   2. Ensuite, traitez le globe oculaire pendant 24 h dans une solution à 10 % de saccharose, puis retirez-le et placez-le pendant 24 h dans une solution à 20 % de saccharose, et enfin, retirez-le et placez-le pendant 24 h dans une solution à 30 % de saccharose.
      REMARQUE : Tout au long du processus, maintenez le globe oculaire à une basse température de 4 °C. Les perforations d’aiguille pour l’infiltration de saccharose doivent être évitées afin de minimiser le risque de lésions oculaires.
3. Congélation et stockage des tissus
   1. Retirez le globe oculaire de la solution de saccharose et séchez-le en le tamponnant légèrement avec une serviette en papier.
   2. Placez le globe oculaire dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 ml et congelez-le à -80 °C pour un traitement ultérieur.
      REMARQUE : S’il est stocké à - 80 °C, un globe oculaire peut rester viable jusqu’à 12 mois jusqu’à un traitement ultérieur.
4. Préparation des lames
   1. Décongelez le globe oculaire à température ambiante. Déplacez-le du tube de microcentrifugation dans une cassette et rincez à l’eau courante pendant 20 minutes pour éliminer le saccharose.
   2. Déshydratez le globe oculaire en le plaçant dans les solutions suivantes, puis en le retirant des solutions suivantes sous une hotte : solution d’alcool éthylique à 70 % (EtOH) pendant 10 min, solution à 80 % d’EtOH pendant 10 min, solution à 96 % d’EtOH pendant 10 min, solution à 99,9 % d’EtOH pendant 10 min et acétone pendant 5 min.
   3. Nettoyez le globe oculaire en le plaçant dans du xylène pendant 5 minutes sous une hotte.
   4. Faites fondre la paraffine en plaçant un peu de paraffine solide dans un bécher et en la mettant dans un incubateur de laboratoire réglé à une température supérieure à la température de fusion spécifiée par le fabricant de la paraffine (la température de fusion de la paraffine est comprise entre 46 °C et 68 °C). Une fois que la paraffine est complètement fondue (le temps dépend de la quantité de paraffine utilisée), déplacez le globe oculaire dans le bécher avec de la paraffine et maintenez-le au chaud dans l’incubateur pendant 1 h. Pendant 1 h d’infiltration de paraffine dans les tissus, remuez la paraffine toutes les 10 à 15 min.
      REMARQUE : Un processeur de tissu qui permet l’infiltration de paraffine pendant l’agitation de la solution peut être utilisé pour cette étape.
   5. Intégrez le globe oculaire dans un bloc de paraffine comme décrit ci-dessous.
      1. Ouvrez la cassette et retirez le capot supérieur. Choisissez un moule en métal et versez une petite quantité de paraffine pour couvrir le fond du moule. Retirez le globe oculaire de la cassette à l’aide d’une pince et placez-le sur la paraffine dans le moule. Placez le globe oculaire sur le côté pour assurer la coupe dans le plan sagittal.
         REMARQUE : Placer le globe oculaire sur son côté (avec le pôle antérieur d’un côté et le pôle postérieur de l’autre) permettra de couper dans le plan sagittal. De cette façon, des coupes à travers la cornée, l’iris, le corps ciliaire, la pupille, la rétine périphérique et centrale seront obtenues.
      2. Refroidissez brièvement le moule sur une plaque de refroidissement réglée à - 15 °C pour que la paraffine se solidifie légèrement afin d’ancrer le tissu en place. Couvrez soigneusement le tissu avec de la paraffine et le fond de la cassette pour former un bloc. Placez le bloc sur une plaque de refroidissement pour qu’il se solidifie complètement. Ensuite, retirez le bloc du moule métallique et replacez les blocs de paraffine sur la plaque de refroidissement pendant au moins 15 min pour refroidir avant de couper.
   6. Fixez un bloc de paraffine dans le microtome. Réglez le microtome pour couper l’excès de paraffine du bloc (nous le réglons pour couper 15 μm) et coupez jusqu’au centre du globe oculaire. Modifiez les paramètres du microtome pour couper des sections plus fines (nous le réglons pour couper 3,5 μm) et placez la section sur une lame. Si vous utilisez un microtome avec un bain-marie adjacent, retirez l’excès d’eau de la lame avec un mouchoir humide.
      REMARQUE : L’objectif est d’obtenir au moins 3 sections transversales à travers la pupille. Moins le chercheur est expérimenté, plus il faut obtenir de sections pour assurer une section au niveau de l’élève. Placez quelques sections sur une seule diapositive. De plus, pour les chercheurs moins expérimentés, coupez le tissu plus épais, par exemple, en sections de 4 μm ou 5 μm d’épaisseur. L’utilisation d’un microtome avec un bain-marie adjacent facilite grandement le processus de transfert de sections de tissus sur des lames par rapport à l’utilisation de microtomes sans bain-marie. Un autre point à noter est que l’objectif peut être difficile à couper. Pour minimiser le risque de lésions tissulaires causées par la lentille fragile, n’utilisez que des lames de microtome tranchantes conçues pour couper les tissus durs. Envisagez d’utiliser une lame pour la coupe et une autre pour couper des sections afin de minimiser l’émoussement de la lame.
   7. Placez la lame dans un incubateur de laboratoire réglé à 56 °C pendant 30 min.
   8. Retirez la lame de l’incubateur et commencez à la colorer manuellement avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) en plaçant et en retirant séquentiellement la lame vers et depuis les solutions suivantes. Commencez avec 7 min de xylène, 5 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre) et 5 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre). Poursuivez avec 2 min 96 % EtOH, 1 min 96 % EtOH (un autre bécher avec une solution propre), 1 min 96 % EtOH (un autre bécher avec une solution propre).
   9. Laver à l’eau courante 5 min, puis 2 min d’hématoxyline de Mayer, 2 min d’hématoxyline de Mayer (un autre bécher avec une solution propre), 5 min d’eau courante, 5 min d’eau courante (un autre bécher propre).
   10. Ajouter 1 % d’éosine pendant 2 min, suivi de 1 min 96 % d’EtOH, 30 s 96 % d’EtOH (un autre bécher avec une solution propre), 30 s 96 % d’EtOH (un autre bécher avec une solution propre), 2 min de xylène, 1 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre), 2 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre).
       REMARQUE : Vous pouvez également utiliser un colorateur de lames automatisé.
   11. Scellez la diapositive à l’aide d’une scelleuse de lames automatisée. La lame préparée est prête à être stockée et évaluée au microscope optique.
       REMARQUE : Vous pouvez également effectuer le scellement manuel de la lame en plaçant une fine couche de polystyrène sur le tissu taché et en le recouvrant d’une lamelle en verre.
       ATTENTION : Les étapes qui incluent le PFA, l’EtOH, l’acétone et le xylène doivent être effectuées sous une hotte de laboratoire.

2. Préparation de la section des globes oculaires de rat et du montage de la glissière

REMARQUE : Ce protocole présente la méthode de préparation de coupes de globes oculaires de rat et a été élaboré à l’aide des globes oculaires prélevés sur : des rats SHR mâles âgés de 6 semaines (poids moyen 115,5 g), des rats SHR mâles âgés de 12 semaines souffrant d’hypertension artérielle (poids moyen 262,5 g), des rats WKY mâles âgés de 6 semaines (poids moyen 143,5 g), des rats WKY mâles âgés de 12 semaines (poids moyen 265 g), des rats Lewis mâles âgés de 12 semaines (poids moyen 310 g) et des rats Lewis mâles âgés de 16 semaines atteints de diabète sucré induit (poids moyen 259 g).

1. Énucléation
   1. Utilisez de petites pinces pour ouvrir les paupières. Appuyez sur les paupières pour faire prolapsus le globe oculaire.
   2. Disséquez le globe oculaire de l’orbite en coupant le tissu derrière le globe oculaire avec de petits ciseaux pointus.
      REMARQUE : Marquez les globes oculaires pour une meilleure orientation, par exemple, en attachant une petite suture sur le moignon du tendon du muscle droit latéral du globe oculaire pour marquer le côté temporal du globe oculaire.
2. Fixation des tissus
   1. Placez le globe oculaire énucléé dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et laissez-le reposer dans une solution à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dissous dans une solution saline tampon de phosphate (PBS) pendant 24 h.
   2. Ensuite, traitez le globe oculaire pendant 24 h dans une solution à 10 % de saccharose, puis retirez-le et placez-le pendant 24 h dans une solution à 20 % de saccharose, et enfin retirez-le et placez-le pendant 24 h dans une solution à 30 % de saccharose.
      REMARQUE : Tout au long du processus, maintenez le globe oculaire à une basse température de 4 °C. Les perforations d’aiguille pour l’infiltration de saccharose doivent être évitées afin de minimiser le risque de lésions oculaires.
3. Congélation et stockage des tissus
   1. Retirez le globe oculaire de la solution de saccharose et séchez-le en le tamponnant légèrement avec une serviette en papier.
   2. Placez le globe oculaire dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 ml et congelez-le à -80 °C pour un traitement ultérieur.
      REMARQUE : S’il est stocké à -80 °C, le globe oculaire peut rester viable jusqu’à 12 mois jusqu’à un traitement ultérieur.
4. Préparation des lames
   1. Retirez le globe oculaire du congélateur et du tube de microcentrifugation. Coupez le globe oculaire en deux le long du plan sagittal avec un scalpel bien aiguisé. Retirez et jetez l’objectif.
      REMARQUE : Cette étape est plus facile à effectuer sur un globe oculaire congelé, fraîchement sorti du congélateur. Lors de la coupe du globe oculaire, le cristallin peut endommager les tissus environnants. Pour minimiser les risques de dommages, utilisez un scalpel très tranchant et restez prudent.
   2. Décongelez le globe oculaire à température ambiante. Déplacez les deux moitiés dans une cassette et rincez à l’eau courante pendant 20 minutes pour éliminer le saccharose.
   3. Déshydratez le globe oculaire en le plaçant dans les solutions suivantes puis en le retirant des solutions suivantes sous une hotte : solution d’alcool éthylique à 70 % (EtOH) pendant 15 min, solution à 80 % d’EtOH pendant 15 min, solution à 96 % d’EtOH pendant 15 min, solution à 99,9 % d’EtOH pendant 15 min et acétone pendant 7 min.
   4. Nettoyez le globe oculaire en le plaçant dans du xylène pendant 7 minutes sous une hotte.
   5. Faites fondre la paraffine en plaçant un peu de paraffine solide dans un bécher et en la mettant dans un incubateur de laboratoire réglé à une température supérieure à la température de fusion spécifiée par le fabricant de la paraffine (la température de fusion de la paraffine est comprise entre 46 °C et 68 °C). Une fois que la parampine est complètement fondue (le temps dépend de la quantité de paraffine utilisée), déplacez le globe oculaire dans le bécher avec de la paraffine et maintenez-le au chaud dans l’incubateur pendant 1 h. Pendant 1 h d’infiltration de paraffine dans les tissus, remuez la paraffine toutes les 10 à 15 min.
      REMARQUE : Un processeur de tissu qui permet l’infiltration de paraffine pendant l’agitation de la solution peut être utilisé pour cette étape.
   6. Intégrez le globe oculaire dans un bloc de paraffine comme décrit ci-dessous.
      1. Ouvrez la cassette et retirez le capot supérieur. Choisissez un moule en métal et versez une petite quantité de paraffine pour couvrir le fond du moule. Retirez le globe oculaire de la cassette à l’aide d’une pince et placez-le sur la paraffine dans le moule. Placez la moitié d’un globe oculaire avec le fond de la tasse vers le haut et l’autre vers le bas.
         REMARQUE : Placer les moitiés du globe oculaire avec une moitié avec le bas de la tasse vers le haut et l’autre vers le bas permettra la coupe des tissus dans le plan sagittal. De cette façon, des coupes à travers la cornée, l’iris, le corps ciliaire, la pupille, la rétine périphérique et centrale seront obtenues.
      2. Refroidissez brièvement le moule sur une plaque de refroidissement réglée à - 15 °C pour que la paraffine se solidifie légèrement et ancre le globe oculaire en place. Couvrez soigneusement le globe oculaire avec de la paraffine et le fond de la cassette pour former un bloc. Placez le bloc sur une plaque de refroidissement pour qu’il se solidifie complètement. Ensuite, retirez le bloc du moule métallique et replacez les blocs de paraffine sur la plaque de refroidissement pendant au moins 15 min pour refroidir avant de couper.
   7. Fixez un bloc de paraffine dans le microtome. Réglez le microtome pour couper l’excès de paraffine du bloc (nous le réglons pour couper 15 μm) et coupez jusqu’à ce que vous atteigniez le centre du globe oculaire. Modifiez les paramètres du microtome pour couper des sections plus fines (nous le réglons pour couper 3,5 μm) et placez la section sur une lame. Si vous utilisez un microtome avec un bain-marie adjacent, retirez l’excès d’eau de la lame avec un mouchoir humide.
      REMARQUE : L’objectif est d’obtenir au moins 3 sections transversales à travers la pupille. Moins le chercheur est expérimenté, plus il faut obtenir de sections pour assurer une section au niveau de l’élève. Placez quelques sections sur une seule diapositive. De plus, pour les chercheurs moins expérimentés, coupez le tissu plus épais, par exemple, en sections de 4 μm ou 5 μm d’épaisseur. L’utilisation d’un microtome avec un bain-marie adjacent facilite grandement le processus de transfert de sections de tissus sur des lames par rapport à l’utilisation de microtomes sans bain-marie.
   8. Retirez la lame et commencez à colorer manuellement avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H&E) en plaçant et en retirant séquentiellement la lame dans et à partir des solutions suivantes. Commencez avec 7 min de xylène, 5 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre) et 5 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre). Poursuivez avec 2 min 96 % EtOH, 1 min 96 % EtOH (un autre bécher avec une solution propre), 1 min 96 % EtOH (un autre bécher avec une solution propre).
   9. Laver à l’eau courante 5 min, puis 2 min d’hématoxyline de Mayer, 2 min d’hématoxyline de Mayer (un autre bécher avec une solution propre), 5 min d’eau courante, 5 min d’eau courante (un autre bécher propre).
   10. Ajouter 1 % d’éosine pendant 2 min, suivi de 1 min 96 % d’EtOH, 30 s 96 % d’EtOH (un autre bécher avec une solution propre), 30 s 96 % d’EtOH (un autre bécher avec une solution propre), 2 min de xylène, 1 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre), 2 min de xylène (un autre bécher avec une solution propre).
       REMARQUE : Vous pouvez également utiliser un colorateur de lames automatisé.
   11. Scellez la diapositive à l’aide d’une scelleuse de lames automatisée. Les lames préparées sont prêtes à être stockées et évaluées au microscope optique.
       REMARQUE : Alternativement, effectuez le scellement de la lame manuellement, en plaçant une fine couche de polystyrène de montage sur le tissu taché et recouvrir par une lamelle en verre.
       ATTENTION : Les étapes qui incluent le PFA, l’EtOH, l’acétone et le xylène doivent être effectuées sous une hotte de laboratoire.

3. Évaluation des sections du globe oculaire

1. Numérisation de diapositives
   1. Placez la lame dans un scanner de lames histopathologique et numérisez les coupes en utilisant le mode de balayage : 40x. Enregistrez les images sous forme de fichiers numériques haute résolution.
2. Analyse de lames
   1. Ouvrez le fichier numérisé à l’aide d’un logiciel de visualisation d’images. Trouvez des sections transversales d’élèves et analysez trois sections consécutives.
   2. Trouvez la partie la plus épaisse de la rétine et agrandissez l’image à 20x en appuyant sur la case de grossissement dans le coin supérieur droit et en choisissant 20x. Déplacez la souris au niveau de l’ELM dans la partie la plus épaisse de la rétine et appuyez sur le bouton droit de la souris, choisissez Annoter et Règle.
   3. Déplacez la souris vers l’ILM et cliquez sur le bouton gauche. Intitulez la mesure RT et cochez les cases afficher le titre et afficher la longueur. De cette façon, l’épaisseur de la rétine (RT) sera mesurée et la mesure sera indiquée en μm. Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 2 et à la figure 3.
   4. À l’aide de la règle, mesurez l’épaisseur de chaque couche rétinienne, y compris l’ONL, l’OPL, l’INL et l’IPL, et étiquetez-les. Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 4 et à la figure 5.
   5. Pour compter le nombre de cellules à l’intérieur du GCL, établissez une longueur prédéterminée de la rétine. Par exemple, pour la rétine de la souris, utilisez une section de 500 μm, et pour la rétine du rat, utilisez cinq sections de 100 μm.
   6. À l’aide de la règle, mesurez la distance choisie le long du GCL. Appuyez sur le bouton droit de la souris et sélectionnez Annoter > Enregistré > 1x RBC. Cliquez sur chaque cellule identifiée comme un corps rond et coloré à l’hématoxyline le long du GCL sur la longueur prédéterminée de la rétine. Comptez le nombre de cellules encerclées. Des résultats représentatifs sont présentés à la figure 6 et à la figure 7.
   7. Après avoir analysé trois sections consécutives, dessinez la moyenne de toutes les mesures.

Résultats

Grâce à l’utilisation du protocole présenté, l’anatomie et la morphologie de structures spécifiques du globe oculaire peuvent être évaluées en détail. Notre équipe se concentre sur la recherche des mécanismes pathologiques de la neurodégénérescence dans les troubles rétiniens, tels que le glaucome, la rétinopathie diabétique et la rétinopathie hypertensive. Pour évaluer les caractéristiques de la neurodégénérescence de la rétine, nous avons évalué le RT (glo...

Discussion

L’examen histologique du globe oculaire de souris et de rat est un outil puissant dans le domaine de l’ophtalmologie expérimentale. Il peut fournir de nouvelles informations sur les changements dans les structures oculaires au cours des maladies ophtalmiques, qui ne seraient pas observés autrement en milieu clinique. Les protocoles décrits présentent une méthode simple pour effectuer une analyse histologique de la rétine. Les subtilités de la procédure nécessaire au traiteme...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Chempur	111024800
Dumont Tweezers #5, 11cm, 0.05 x 0.01mm Tips	World Precision Instruments	14095	small, microsurgical forceps
Eosin	Mar-Four	4P.05.2001/L	Aqueous solution
Ethyl alcohol 96 %	Chempur	CH.ET.AL.96%CZDA.CH
Ethyl alcohol 99.9 %	Chempur	CH.ETYL.ALK.99,9%BW	Use to prepare 70% and 80% solutions of EtOH
Glacier - 86 °C Ultralow Temperature Freezer NU-9483E	NuAire	13027D0034	Freezing temperature - 80 °C
Glass slides	Mar-Four	MI.15.01673	Ground glass slides with a double-sided matte field for description
Leica CV5030 Fully Automated Glass Coverslipper	Leica Biosystems	14,04,78,80,101	Automated slide sealer
Mayer's hematoxylin	Chempur	124687402
Metal base molds 15 mm  x 15 mm	Leica Biosystems	3803081
Microme HM 340 E	Thermo Scientific	90-519-0	Microtome
Microtome razor blades	Mar-Four	HI.N.35	Cutting angle 35°
Micro-Twin biopsy cassette	Mar-Four	LN.13874550
Microwave Hybrid Tissue Processor	Milestone
Multistainer Leica ST5020	Leica Biosystems		Automated slide stainer
NanoZoomer 2.0-HT slide scanner	Hamamatsu	C9600	Histopathological slide scanner
NDP.view2 Image viewing software	Hamamatsu	U12388-01	Image viewing software
Paraffin Pathowax Plus	Mar-Four	4P.PWP.010	Melting temperature 56 °C - 58 °C
Paraformaldehyde	Sigma - Aldrich	441244-1KG	Prepare a 4% solution in PBS
PBS Tablets	Merck Millipore	524650-1EA	Use to prepare a solution of phosphate buffer saline, per manufacturer's instructions
Pierce Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Thermo Scientific	69715
Refrigerator-freezer EN14000AW	Electrolux	925032562-00	refrigeration 4 °C
Scalpel blade	Swann-Morton	T.OST.SKAL00.024
Sucrose	Chempur	427720906
SuperCut Spring Scissors, 12.5cm, Curved	World Precision Instruments	501925	curved, small microsurgical scissors
Tape for automatic sealers	Mar-Four	KP-3020/SMRH001
Xylene	Chempur	CH.KSYL.5l.METAL.OP