JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Une méthode d’enregistrement électrophysiologique rarement utilisée, l’enregistrement de base, permet d’analyser des caractéristiques du codage du goût qui ne peuvent pas être examinées par les méthodes d’enregistrement conventionnelles. L’enregistrement de base permet également d’analyser les réponses gustatives à des stimuli hydrophobes qui ne peuvent pas être étudiés à l’aide des méthodes électrophysiologiques traditionnelles.

Résumé

Les insectes goûtent le monde extérieur à travers les poils gustatifs, ou sensilles, qui ont des pores à leurs extrémités. Lorsqu’un sensillum entre en contact avec une source de nourriture potentielle, les composés de la source de nourriture pénètrent par les pores et activent les neurones à l’intérieur. Depuis plus de 50 ans, ces réponses ont été enregistrées à l’aide d’une technique appelée enregistrement des pointes. Cependant, cette méthode présente des limites majeures, notamment l’incapacité de mesurer l’activité neuronale avant ou après le contact avec un stimulus et l’exigence que les arômes soient solubles dans les solutions aqueuses. Nous décrivons ici une technique que nous appelons enregistrement de base, qui permet de surmonter ces limitations. L’enregistrement de base permet de mesurer l’activité des neurones gustatifs avant, pendant et après le stimulus. Ainsi, il permet une analyse approfondie des réponses OFF qui se produisent après un stimulus gustatif. Il peut être utilisé pour étudier des composés hydrophobes tels que les phéromones à longue chaîne qui ont une très faible solubilité dans l’eau. En résumé, l’enregistrement de base offre les avantages de l’électrophysiologie monosensille comme moyen de mesurer l’activité neuronale - haute résolution spatiale et temporelle, sans avoir besoin d’outils génétiques - et surmonte les principales limites de la technique traditionnelle d’enregistrement des pointes.

Introduction

Les insectes, y compris les mouches drosophiles, sont dotés d’un système gustatif sophistiqué qui leur permet d’extraire des informations chimiques complexes de leur environnement. Ce système leur permet de discerner la composition chimique de diverses substances, en distinguant celles qui sont nutritives et celles qui sont nocives 1,2.

Au cœur de ce système se trouvent des structures spécialisées connues sous le nom de poils gustatifs ou sensilles, stratégiquement situées sur diverses parties du corps. Chez les mouches drosophiles, ces sensilles sont situées sur le labelle, qui est le principal organe gustatif de la tête de mouche 1,2,3,4, ainsi que sur les pattes et les ailes 1,2,5,6. Le labelle est situé à l’extrémité de la trompe et contient deux lobes4, 7 et 8. Chaque lobe est recouvert de 31 sensilles gustatives classées en courtes, longues et intermédiaires 4,7,8. Ces sensilles abritent chacune 2 à 4 neurones gustatifs1, 2, 9, 10. Ces neurones gustatifs expriment les membres d’au moins quatre familles de gènes différentes, à savoir les gènes 1,2,11,13 du récepteur gustatif (Gr), du récepteur ionotrope (Ir), du pickpocket (Ppk) et du potentiel de récepteur transitoire (Trp). Cette diversité de récepteurs et de canaux donne aux insectes la capacité de reconnaître un large éventail de composés chimiques, y compris les signaux non volatils et volatils 1,2,14.

Depuis plus de 50 ans, les scientifiques quantifient la réponse des neurones gustatifs et de leurs récepteurs à l’aide d’une technique appelée enregistrement des pointes 3,4,6,8,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,
29,30,31,32,33,34,35. Cependant, cette méthode présente des limites majeures. Tout d’abord, l’activité neuronale ne peut être mesurée que pendant le contact avec le stimulus, et non avant ou après le contact. Cette limitation empêche la mesure de l’activité de pic spontané et empêche la mesure des réponses OFF. Deuxièmement, seuls les arômes solubles dans les solutions aqueuses peuvent être testés.

Ces limitations peuvent être surmontées par une technique électrophysiologique alternative rarement utilisée appelée « enregistrement de base ». Nous décrivons ici cette technique, que nous avons adaptée d’une méthode utilisée par Marion-Poll et ses collègues24, et montrons les caractéristiques cruciales de codage du goût qu’elle peut maintenant mesurer commodément14.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Le protocole suivant est conforme à toutes les directives de soins aux animaux de l’Université de Yale.

1. Mouches

  1. Placez 10 à 15 mouches nouvellement levées dans des flacons de culture standard frais à 25 °C et à 60 % d’humidité relative selon un cycle lumière-obscurité de 12:12 h.
  2. Utilisez des mouches à l’âge de 3 à 7 jours.

2. Stimuli chimiosensoriels

  1. Obtenez des stimuli chimiosensoriels de la plus haute pureté disponible. Stockez-les selon les recommandations du fournisseur jusqu’à utilisation.
  2. Dissoudre les stimuli chimiosensoriels et les diluer aux concentrations souhaitées dans de l’eau ou un autre solvant non toxique tel que l’huile de paraffine. Agiter les solutions préparées pendant au moins 1 h dans le cas de composés solides dissous.

3. Stimulus capillaire en verre

  1. Tirez un capillaire en verre pour retenir le stimulus d’un capillaire en verre borosilicaté (100 mm de longueur, 1 mm de diamètre extérieur, 0,58 mm de diamètre intérieur) à l’aide d’un instrument d’extraction de pipette. Visez à atteindre un diamètre de pointe compris entre 3 μm et 10 μm.
  2. Remplissez le capillaire en verre avec la solution de stimulation préférée à l’aide d’une pointe de pipette à microchargeur. Veillez à éviter les bulles, qui peuvent être éliminées en tapotant doucement.
  3. Si le stimulus cristallise à l’extrémité, nettoyez ou remplacez le capillaire de stimulus en verre.

4. Électrodes de référence et d’enregistrement

  1. Utilisez des tiges de tungstène (127 μm de diamètre et 76,2 mm de longueur) pour les électrodes de référence et d’enregistrement. Affûter les électrodes de référence et d’enregistrement à environ 1 μm de diamètre à l’extrémité (les formes de ces électrodes sont décrites dans Delventhal et al.36) en les trempant à plusieurs reprises pendant plusieurs secondes dans une solution de KNO3 à 10 % (~1 M) ou une solution de KOH à 10 % (1,8 M).
    REMARQUE : Cette solution nécessite un courant (0,3-3 mA) pour faciliter ce processus.

5. Préparation de la mouche pour l’enregistrement de base

  1. Prélevez une seule mouche de la fiole dans un aspirateur. Retirez l’aspirateur et piégez l’animal en plaçant un doigt sur l’extrémité.
  2. Expulsez la mouche dans une pointe de pipette en plastique de 200 μL. En gardant l’extrémité de l’aspirateur dans la pointe de la pipette, utilisez l’extrémité pour pousser la mouche vers l’avant, la tête la première, vers l’extrémité étroite de la pointe de la pipette.
  3. Coupez la pointe de la pipette à chaque extrémité (c’est-à-dire à l’avant et à l’arrière de l’animal) à l’aide d’une lame de rasoir.
  4. Utilisez de l’argile ou un petit morceau de coton pour pousser la mouche vers l’avant, jusqu’à ce que la moitié de la tête dépasse de l’extrémité de la pointe de la pipette taillée. À l’aide d’une pince, poussez doucement jusqu’à ce que le labelle à l’avant de la tête soit exposé.
  5. Fixez la pointe de pipette taillée sur une lame de microscope en verre à l’aide d’argile (Figure 1).
  6. Au stéréomicroscope, placez le labelle latéralement sur une lamelle de manière à ce qu’un lobe, ainsi que ses 31 sensilles gustatives, soient exposés (figure 1). Le couvercle maintient l’étiquette en place.

6. Plate-forme d’électrophysiologie

  1. Choisissez une pièce pour l’installation de l’appareil de forage dont la température et l’humidité relative sont stables (<70 %) et qui est isolée des sources de bruit électrique et mécanique, telles que les réfrigérateurs et les centrifugeuses.
  2. Placez le microscope au centre d’une table antivibratoire.
  3. Fixez un micromanipulateur manuel à la table antivibratoire (Figure 2).
  4. Fixez un arbre en acier inoxydable qui maintient l’électrode de référence en tungstène au micromanipulateur manuel (Figure 2).
  5. Connectez des manipulateurs motorisés - l’un avec un support pour la sonde d’électrode d’enregistrement et l’autre avec un support relié à un arbre en acier inoxydable pour le capillaire de stimulation en verre - à la même table à l’aide de supports (Figure 2).
  6. Connectez la sonde d’électrode d’enregistrement à un système IDAC (Intelligent Data Acquisition Controller) ou à un autre système d’amplificateur/numériseur.
  7. Reliez ce système IDAC à l’ordinateur du poste de travail.
  8. Mettez à la terre les manipulateurs manuels et motorisés au même endroit dans la plate-forme.
  9. Installez le logiciel d’acquisition approprié pour le système IDAC sur l’ordinateur. Assurez-vous que les pilotes d’acquisition numérique sont compatibles avec le système d’exploitation (par exemple, Windows XP-7, -8 ou -10) de l’ordinateur.

7. Enregistrement à partir de la sensille gustative

  1. Placez la lame de préparation sur la platine du microscope avec un objectif à faible grossissement (par exemple, 10x) en position. Déplacez la platine jusqu’à ce que le labelle soit net au centre du champ de vision aux objectifs à faible et à fort grossissement (par exemple, 50x).
  2. Insérez l’électrode de référence dans l’œil à l’aide de l’objectif à faible grossissement. Pour insérer l’électrode de référence, ciblez l’œil du côté de la mouche opposé au côté avec l’électrode d’enregistrement, par exemple, si l’électrode d’enregistrement s’approche de la droite, placez l’électrode de référence dans l’œil gauche. Utilisez un micromanipulateur manuel pour une insertion précise.
  3. Faites la mise au point sur l’extrémité du capillaire de stimulus du verre au centre du champ de vision des objectifs à faible et à fort grossissement à l’aide d’un micromanipulateur motorisé (Figure 3).
  4. Sous un faible grossissement, approchez l’électrode d’enregistrement du labelle à l’aide d’un deuxième micromanipulateur motorisé.
  5. Sous un grossissement élevé, insérez l’électrode d’enregistrement dans la base d’un sensillum gustatif à l’aide du micromanipulateur motorisé jusqu’à ce que le son de l’activité neuronale de la sortie audio du système IDAC soit entendu.
  6. Une fois qu’un signal stable a été établi, commencez à enregistrer le signal à l’aide du logiciel fourni avec le système IDAC (Figure 4A-D). Pour démarrer l’enregistrement, appuyez sur le bouton Démarrer l’enregistrement.
  7. Amenez l’extrémité du stimulus capillaire en verre pour couvrir l’extrémité du sensillum gustatif à l’aide du manipulateur motorisé.
  8. Pour terminer le stimulus, retirez le capillaire de stimulation en verre du sensillum à l’aide du manipulateur motorisé.
  9. Marquez manuellement le début et la fin de la stimulation à l’aide d’une pédale. La pédale est connectée à l’IDAC, et sa communication avec le logiciel est facilitée par l’IDAC pour marquer le début/la fin du stimulus.

8. Analyse

  1. Utilisez les différentes fonctions du logiciel fourni avec le système IDAC pour trier les populations de pics par amplitude (lorsque cela est possible) et analyser la dynamique des réponses.
    1. Pour compter les pointes, faites un clic gauche sur l’enregistrement qui vous intéresse, faisant apparaître une fenêtre parmi laquelle choisir. Choisissez Jusqu’aux pics, en lançant une autre fenêtre nommée Convertir les vagues en pics. Entrez un nom dans le champ Nouveau et appuyez sur le bouton OK .
    2. La saisie du nom dans le champ Nouveau à l’étape 8.1.1 permet d’accéder à la vue Histogramme d’amplitude . Choisissez l’amplitude à compter, puis fermez cette vue. Faites un clic gauche pour ajouter un compteur.
    3. Examinez les pics manuellement pour confirmer les conclusions basées sur l’analyse à l’aide d’un logiciel.
      REMARQUE : Le logiciel permet également l’exportation de données dans différents formats pour une analyse plus approfondie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

La figure 4A montre des pointes spontanées qui naissent d’un sensillum. Ils se divisent en deux classes en fonction de l’amplitude, les pointes les plus grandes dérivant du neurone sensible aux composés amers et les pointes plus petites du neurone qui répond aux sucres. La relation entre l’amplitude du pic et la spécificité fonctionnelle a été corroborée par des expériences génétiques 4,14,37,38,39 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Dans les enregistrements de certains types de sensilles, il peut être difficile de différencier les pointes de différents neurones. Par exemple, les neurones à sucre et les neurones mécanosensoriels des sensilles S et I produisent des pointes d’amplitudes similaires, ce qui rend difficile leur distinction 4,14. Nous constatons que l’utilisation d’une électrode d’enregistrement en tungstène très tranchante réduit l’activation du neurone mécanos...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Nous remercions Zina Berman pour son soutien, Lisa Baik pour ses commentaires sur le manuscrit et les autres membres du laboratoire Carlson pour la discussion. Ce travail a été soutenu par la subvention NIH K01 DC020145 à H.K.M.D ; et le NIH accorde les DC02174 R01, R01 DC04729 et R01 DC011697 à J.R.C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
MicroscopeOlympusBX51WIequipped with a 50X objective (LMPLFLN 50X, Olympus) and 10X eyepieces. 
Antivibration TableTMC63-7590E
motorized MicromanipulatorsHarvard Apparatus and Märzhäuser MicromanipulatorsMicromanipulator PM 10 Piezo Micromanipulator
manual MicromanipulatorsMärzhäuser MicromanipulatorsMM33 Micromanipulator
Magnetic standsENCOModel #625-0930
Reference  and recording Electrode HolderOckenfels Syntech GmbH
Stimulus glass capillary HolderOckenfels Syntech GmbH
Universal Single Ended ProbeOckenfels Syntech GmbH
4-CHANNEL USB ACQUISITION CONTROLLER , IDAC-4Ockenfels Syntech GmbH
Stimulus ControllersOckenfels Syntech GmbHStimulus Controller CS 55
Personal ComputerDellVostroCheck for compatibility with digital acquisition system and software
Tungsten RodA-M SystemsCat#716000
Aluminum Foil and/or Faraday CageElectromagnetic noise shielding
Borosilicate Glass CapillariesWorld Precision Instruments1B100F-4
Pipette PullerSutter Instrument CompanyModel P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller
StereomicroscopeOlympusVMZ 1x-4xFor fly preparation
p200 Pipette TipsGeneric
Microloader tips EppendorfE5242956003
1 ml SyringeGeneric
Crocodile clips
Power TransformersSTACO ENERGY PRODUCTSSTACO 3PN221BAssembled from P1000 pipette tips, flexible plastic tubing, and mesh
Modeling ClayGeneric
ForcepsGeneric
Plastic TubingSaint GobainTygon S3™ E-3603
Standard culture vialsArchon ScientificNarrow 1-oz polystyrene vails, each with 10 mL of glucose medium, preloaded with cellulose acetate plugs
Berberine chloride (BER)Sigma-AldrichCat# Y0001149
Denatonium benzoate (DEN)Sigma-AldrichCat# D5765
N,N-Diethyl-m- toluamide (DEET)Sigma-AldrichCat# 36542

Références

  1. Joseph, R. M., Carlson, J. R. Drosophila chemoreceptors: a molecular interface between the chemical world and the brain. Trends Genet. 31 (12), 683-695 (2015).
  2. Montell, C. Drosophila sensory receptors-a set of molecular Swiss Army Knives. Genetics. 217 (1), 1-34 (2021).
  3. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Molecular logic and evolution of bitter taste in Drosophila. Curr Biol. 30 (1), 17-30 (2020).
  4. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  5. He, Z., Luo, Y., Shang, X., Sun, J. S., Carlson, J. R. Chemosensory sensilla of the Drosophila wing express a candidate ionotropic pheromone receptor. PLoS Biol. 17 (5), e2006619(2019).
  6. Ling, F., Dahanukar, A., Weiss, L. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of taste coding in the legs of Drosophila. J Neurosci. 34 (21), 7148-7164 (2014).
  7. Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
  8. Hiroi, M., Meunier, N., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Two antagonistic gustatory receptor neurons responding to sweet-salty and bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 61 (3), 333-342 (2004).
  9. Shanbhag, S. R., Park, S. K., Pikielny, C. W., Steinbrecht, R. A. Gustatory organs of Drosophila melanogaster: fine structure and expression of the putative odorant-binding protein PBPRP2. Cell Tissue Res. 304 (3), 423-437 (2001).
  10. Siddiqi, O., Rodrigues, V. Genetic analysis of a complex chemoreceptor. Basic Life Sci. 16, 347-359 (1980).
  11. Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
  12. Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
  13. Sánchez-Alcañiz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nat Commun. 9 (1), 4252(2018).
  14. Dweck, H. K. M., Carlson, J. R. Diverse mechanisms of taste coding in Drosophila. Sci Adv. 9 (46), (2023).
  15. Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. Drosophila Gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, Suppl 2 14526-14530 (2003).
  16. Dahanukar, A., Lei, Y. T., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. Two Gr genes underlie sugar reception in Drosophila. Neuron. 56 (3), 503-516 (2007).
  17. Delventhal, R., Carlson, J. R. Bitter taste receptors confer diverse functions to neurons. Elife. 5, e11181(2016).
  18. Dweck, H. K. M., Talross, G. J. S., Luo, Y., Ebrahim, S. A. M., Carlson, J. R. Ir56b is an atypical ionotropic receptor that underlies appetitive salt response in Drosophila. Curr Biol. 32 (8), 1776-1787 (2022).
  19. Hiroi, M., Marion-Poll, F., Tanimura, T. Differentiated response to sugars among labellar chemosensilla in Drosophila. Zoolog Sci. 19 (9), 1009-1018 (2002).
  20. Jeong, Y. T., et al. An odorant-binding protein required for suppression of sweet taste by bitter chemicals. Neuron. 79 (4), 725-737 (2013).
  21. Jiao, Y., Moon, S. J., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for the responses to sucrose, glucose, and maltose identified by mRNA tagging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 14110-14115 (2007).
  22. Jiao, Y., Moon, S. J., Wang, X., Ren, Q., Montell, C. Gr64f is required in combination with other gustatory receptors for sugar detection in Drosophila. Curr Biol. 18 (22), 1797-1801 (2008).
  23. Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
  24. Lacaille, F., et al. An inhibitory sex pheromone tastes bitter for Drosophila males. PLoS One. 2 (7), e661(2007).
  25. Lee, Y., et al. Gustatory receptors required for avoiding the insecticide L-canavanine. J Neurosci. 32 (4), 1429-1435 (2012).
  26. Lee, Y., Kim, S. H., Montell, C. Avoiding DEET through insect gustatory receptors. Neuron. 67 (4), 555-561 (2010).
  27. Lee, Y., Moon, S. J., Montell, C. Multiple gustatory receptors required for the caffeine response in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (11), 4495-4500 (2009).
  28. Lee, Y., Moon, S. J., Wang, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor required for strychnine sensation. Chem Senses. 40 (7), 525-533 (2015).
  29. Meunier, N., Marion-Poll, F., Rospars, J. P., Tanimura, T. Peripheral coding of bitter taste in Drosophila. J Neurobiol. 56 (2), 139-152 (2003).
  30. Moon, S. J., Köttgen, M., Jiao, Y., Xu, H., Montell, C. A taste receptor required for the caffeine response in vivo. Curr Biol. 16 (18), 1812-1817 (2006).
  31. Moon, S. J., Lee, Y., Jiao, Y., Montell, C. A Drosophila gustatory receptor essential for aversive taste and inhibiting male-to-male courtship. Current Biology. 19, 1623-1627 (2009).
  32. Rimal, S., et al. Mechanism of acetic acid gustatory repulsion in Drosophila. Cell Rep. 26 (6), 1432-1442 (2019).
  33. Shim, J., et al. The full repertoire of Drosophila gustatory receptors for detecting an aversive compound. Nat Commun. 6, 8867(2015).
  34. Xiao, S., Baik, L. S., Shang, X., Carlson, J. R. Meeting a threat of the Anthropocene: Taste avoidance of metal ions by Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (25), e2204238119(2022).
  35. Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
  36. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355(2014).
  37. Marella, S., et al. Imaging taste responses in the fly brain reveals a functional map of taste category and behavior. Neuron. 49 (2), 285-295 (2006).
  38. Thorne, N., Amrein, H. Atypical expression of Drosophila gustatory receptor genes in sensory and central neurons. J Comp Neurol. 506 (4), 548-568 (2008).
  39. Wang, Z., Singhvi, A., Kong, P., Scott, K. Taste representations in the Drosophila brain. Cell. 117 (7), 981-991 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Ce mois ci dans JoVEnum ro 205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.