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Microinjection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Dans cet article
Résumé
Cet article prend l’exemple de la transgenèse médiée par l’intégrase phiC31 chez la drosophile et présente un protocole optimisé pour la micro-injection embryonnaire, une étape cruciale pour la création de mouches transgéniques.
Résumé
La transgenèse chez la drosophile est une approche essentielle pour étudier la fonction des gènes au niveau de l’organisme. La micro-injection d’embryons est une étape cruciale pour la construction des mouches transgéniques. La micro-injection nécessite certains types d’équipement, notamment un micro-injecteur, un micromanipulateur, un microscope inversé et un stéréomicroscope. Les plasmides isolés à l’aide d’un kit de miniprep plasmidique sont qualifiés pour la micro-injection. Les embryons au stade pré-blastoderme ou blastoderme syncytial, où les noyaux partagent un cytoplasme commun, sont soumis à une micro-injection. Une passoire cellulaire facilite le processus de déchâtionnement des embryons. Le moment optimal pour la déchorionisation et la dessiccation des embryons doit être déterminé expérimentalement. Pour augmenter l’efficacité de la micro-injection d’embryons, les aiguilles préparées par un extracteur doivent être biseautées par un broyeur d’aiguilles. Dans le processus de broyage des aiguilles, nous utilisons une pompe à air à pied avec un manomètre pour éviter l’effet capillaire de la pointe de l’aiguille. Nous injectons régulièrement 120 à 140 embryons pour chaque plasmide et obtenons au moins une lignée transgénique pour environ 85 % des plasmides. Cet article prend l’exemple de la transgenèse médiée par l’intégrase phiC31 chez la drosophile et présente un protocole détaillé pour la micro-injection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile.
Introduction
La mouche des fruits Drosophila melanogaster est extrêmement sensible à la manipulation génétique et à l’analyse génétique. Les mouches des fruits transgéniques sont largement utilisées dans la recherche biologique. Depuis son développement au début des années 1980, la transgenèse médiée par le transposon de l’élément P est indispensable à la recherche sur la drosophile 1. Dans certains scénarios, d’autres transposons, tels que piggyBac et Minos, ont également été utilisés pour la transgenèse chez la drosophile 2. Les transgènes via transposon sont insérés au hasard dans le génome de la dro....
Protocole
1. Préparation des plasmides
- Isolez les plasmides de 4 ml de cultures bactériennes pendant la nuit à l’aide d’une trousse de minipréparation de plasmides. Éluer avec 40 μL de tampon d’élution.
REMARQUE : L’isolement des plasmides à l’aide d’un kit de préparation de plasmides n’est pas nécessaire. Un kit de miniprep plasmidique peut répondre pleinement aux exigences expérimentales de la micro-injection d’embryons. Dans ce protocole, les plasmides UAS-ADNc/ORF préparés contiennent dix copies de UAS, un promoteur minimal Hsp70, un site attB, un gène mini-blanc et un gène d’intérêt. - Déterminez la concentration d’ADN plasmidique à l’....
Résultats Représentatifs
La pointe d’une aiguille d’injection est biseautée par une meuleuse à aiguilles (Figure 1). On peut biseauter 50 à 60 aiguilles en une heure. L’ADN est micro-injecté dans la partie postérieure d’un embryon au stade pré-blastoderme ou blastoderme syncytial, où les noyaux partagent un cytoplasme commun (Figure 2A). La partie postérieure d’un embryon peut être facilement localisée grâce au micropyle situé à l’avant de l’embryon (
Discussion
Ici, nous présentons un protocole de micro-injection embryonnaire pour la transgenèse chez la drosophile. Pour la transgenèse spécifique du site médiée par phiC31, nous avons injecté 120 à 140 embryons pour chaque plasmide et obtenu au moins une lignée transgénique pour environ 85 % des plasmides (tableau supplémentaire 2). D’après notre expérience, l’ADN plasmidique isolé par un kit de mini-préparation plasmidique suffit pour la transgenèse chez la drosophile. Des c.......
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les travaux ont été soutenus par le Fonds de recherche scientifique pour les talents de haut niveau de l’Université de Chine du Sud.
....matériels
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 μm Cell Strainer | NEST | 258367 | |
| 3M double-sided adhesive | 3M | 415 | |
| Borosilicate glass | SUTTER | B100-75-10 | |
| Diamond abrasive plate | SUTTER | 104E | |
| FLAMING/BROWN Micropipette Puller | SUTTER | P-1000 | |
| Foot air pump with pressure gauge | Shenfeng | SF8705D | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma | H8773 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2R | |
| Microinjection pump | eppendorf | FemtoJet 4i | |
| Micromanipulator | eppendorf | TransferMan 4r | |
| Micropipette Beveler | SUTTER | BV-10 | |
| Microscope cover glasses (18 mm x 18 mm) | CITOLAS | 10211818C | |
| Microscope slides (25 mm x 75 mm) | CITOLAS | 188105W | |
| Petri dish (90 mm x 15 mm) | LAIBOER | 4190152 | |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1026269 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ745 |
Références
- Rubin, G. M., Spradling, A. C. Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science. 218 (4570), 348-353 (1982).
- Venken, K. J., Bellen, H. J. Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.
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