Imagerie en direct pour quantifier la radiosensibilité cellulaire dans les organoïdes tumoraux dérivés de patients

Résumé

Ici, nous détaillons une approche simple d’imagerie en direct pour quantifier la sensibilité des organoïdes tumoraux dérivés de patients aux rayonnements ionisants.

Résumé

La radiothérapie (RT) est l’un des piliers de la prise en charge clinique moderne du cancer. Cependant, tous les types de cancer ne sont pas aussi sensibles à l’irradiation, souvent (mais pas toujours) en raison des différences dans la capacité des cellules malignes à réparer les dommages oxydatifs à l’ADN provoqués par les rayons ionisants. Les tests clonogéniques sont utilisés depuis des décennies pour évaluer la sensibilité des cellules cancéreuses en culture à l’irradiation ionisante, en grande partie parce que les cellules cancéreuses irradiées meurent souvent d’une manière retardée qui est difficile à quantifier avec des techniques assistées par cytométrie en flux à court terme ou par microscopie. Malheureusement, les tests clonogéniques ne peuvent pas être utilisés en tant que tels pour des modèles tumoraux plus complexes, tels que les organoïdes tumoraux dérivés de patients (PDTO). En effet, l’irradiation des PDTO établies n’interrompt pas nécessairement leur croissance en tant qu’unités multicellulaires, à moins que leur compartiment semblable à celui d’une tige ne soit complètement éradiqué. De plus, l’irradiation de suspensions unicellulaires dérivées de PDTO peut ne pas récapituler correctement la sensibilité des cellules malignes à la RT dans le contexte des PDTO établies. Ici, nous détaillons une adaptation des tests clonogéniques conventionnels qui implique l’exposition de PDTO établis à des rayonnements ionisants, suivie d’une dissociation unicellulaire, d’un replacage dans des conditions de culture appropriées et d’une imagerie en direct. Des cellules souches non irradiées (témoins) dérivées de PDTO reforment des PDTO en croissance avec une efficacité spécifique à PDTO, qui est négativement influencée par l’irradiation de manière dose-dépendante. Dans ces conditions, l’efficacité et le taux de croissance de la formation des PDTO peuvent être quantifiés comme une mesure de la radiosensibilité sur des images en accéléré collectées jusqu’à ce que les PDTO de contrôle atteignent une occupation d’espace prédéfinie.

Introduction

La radiothérapie externe (RT) est l’un des piliers de l’oncologie moderne, reflétant non seulement une activité anticancéreuse prononcée associée à un spectre bien défini d’effets secondaires généralement gérables¹, mais aussi une disponibilité clinique exceptionnellement répandue (la plupart des centres de cancérologie des pays développés sont équipés d’accélérateurs linéaires modernes pour la RT externe)². Conformément à cette notion, la RT est utilisée avec succès à l’échelle mondiale à des fins curatives, généralement dans le contexte d’une maladie à un stade précoce

Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Culture d’organoïdes

REMARQUE : Les PDTO TNBC#1 ont été établies dans notre laboratoire sur la base d’un tissu tumoral retiré chirurgicalement d’une patiente atteinte d’un cancer du sein triple négatif (TNBC) qui a fourni un consentement éclairé pour participer à un protocole de biobanque (IRB21-06023682). Après validation par histologie et séquençage de l’ARN (RNAseq), les PDTO TNBC#1 sont cultivés en gouttes de matrigel à 66 % (appelées « dômes ») dan....

Discussion

Ici, nous décrivons une adaptation des tests clonogènes conventionnels qui exploite les PDTO du cancer du sein et l’imagerie en direct pour quantifier la radiosensibilité des PDTO en fonction de (1) la persistance des cellules souches formant des PTDO lors de l’irradiation des PDTO in vitro, et (2) le taux de croissance des PDTO que ces cellules (peuvent) générer. Les étapes critiques de ce protocole comprennent (1) l’établissement de PDTO à une occupation du dôme.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm mesh filter	Thomas Scientific	1164H35
B27	Invitrogen	17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter	Nexcelom
DMEM F/12	Corning	12634-010
Epidermal Growth Factor hEGF	Peprotech	AF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope	Thermo Fisher Scientific	12-563-460
FGF10	Peprotech	100-26
FGF7	Peprotech	100-19
GlutaMax	Invitrogen	35050061
Hepes	Invitrogen	15630-080
IncuCyte software 2021A	Sartorius		version: 2021A
Incucyte SX1	Sartorius		model SX1
Incucyte validated 48 well plate	Corning	3548
Matrigel	Discovery Labware	354230
nAc	Sigma Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Non-treated 6 well plate	Cellstar	657 185
NR (Heregulin)	Peprotech	100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190	Sigma Aldrich	S7067
PBS	Corning	21-040-CV
PenStrep	Invitrogen	15140-122
Primocin	Invivogen	ant-pm-1
Rspondin Media			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP)	Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01	Tocris	2939
Trypan blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-61
TrypLE	Gibco	112605-028
Y-27632 (RhoKi)	Selleck	S1049