Prélèvement sanguin et mesure hormonale pour déterminer le stade du cycle ovarien chez les ouistitis

Résumé

Ce protocole décrit des prélèvements sanguins et urinaires pour mesurer les taux de progestérone/œstradiol et de gonadotrophine chorionique afin de déterminer le stade du cycle ovarien. Les niveaux d’hormones sont utilisés pour prédire et déterminer le moment de l’ovulation et des hormones sont injectées pour réguler le cycle ovarien et la croissance des ovocytes.

Résumé

Les ouistitis communs sont de petits singes du Nouveau Monde. Étant donné que bon nombre de leurs mécanismes biologiques sont similaires à ceux des humains, les ouistitis sont potentiellement utiles pour la recherche médicale et en biologie humaine dans une gamme de domaines, tels que les neurosciences, la médecine régénérative et le développement. Cependant, il y a un manque de littérature décrivant les méthodes pour de nombreuses expériences et procédures de base. Ici, des méthodes détaillées pour déterminer les niveaux d’hormones sexuelles (progestérone, œstradiol et gonadotrophine chorionique) chez les ouistitis sont décrites. La mesure de ces hormones permet de prédire le stade du cycle ovarien, qui est généralement de 26 à 30 jours chez les ouistitis ; Une détermination précise est essentielle pour la récolte des ovocytes/zygotes au bon moment et pour la préparation des femelles hôtes à la génération de ouistitis génétiquement modifiés.

De plus, la mesure des niveaux d’hormones sexuelles est utile pour l’endocrinologie, l’éthologie, le développement précoce et les études de biologie de la reproduction. Ce protocole fournit une description détaillée des méthodes de prélèvement sanguin dans la veine fémorale, de séparation du plasma pour la mesure hormonale, de mesure des taux de gonadotrophine chorionique à l’aide de l’urine et du plasma, de réinitialisation du cycle ovarien à l’aide d’injections d’un analogue de la prostaglandine F2α pour raccourcir et synchroniser le cycle, et de favoriser la croissance folliculaire et l’ovulation par injection d’hormone folliculo-stimulante et de gonadotrophine chorionique. À l’aide de ces protocoles, les étapes du cycle ovarien peuvent être déterminées pour la collecte rapide des ovocytes/zygotes.

Introduction

Le ouistiti commun (Callithrix jacchus) est un petit singe du Nouveau Monde avec de nombreuses caractéristiques similaires à celles des humains, et la durée de son cycle ovarien est de 26-30 jours ^1,2. Les études sur le développement précoce et la génération de ouistitis génétiquement modifiés nécessitent le prélèvement d’ovocytes et de zygotes à des stades spécifiques du cycle ovarien. Ainsi, la détermination précise du stade est cruciale et peut être estimée en mesurant les taux sanguins des hormones progestérone (P4) et œstradiol (E2)^2,3. Ces hormones favorisent la croissance de l’endomètre, nécessaire à l’implantation. P4 est produit à partir du corps jaune, qui se forme dans les ovaires immédiatement après l’ovulation. L’E2 est sécrété par les follicules ovariens en réponse à l’hormone folliculo-stimulante (FSH) du complexe hypothalamus-hypophyse dans le cerveau. Les niveaux d’E2 augmentent à mesure que le follicule mûrit, atteignant un pic avant l’ovulation³. Des niveaux élevés d’E2 provoquent la libération pulsée de l’hormone lutéinisante (LH) via le complexe hypothalamus-hypophyse chez l’homme ; cette poussée de LH induit l’ovulation. Cependant, chez les ouistitis, le gène LH a subi une dégénérescence au cours de l’évolution, et l’ovulation est plutôt induite par la libération de gonadotrophine chorionique (CG), qui a une structure similaire à celle de LH, de la glande pituitaire ^4,5.

Le cycle ovarien peut être contrôlé par des injections d’hormones. Les injections de FSH, chez l’homme, agissent sur les récepteurs de la FSH ovarienne et sont utilisées pour favoriser la synthèse des œstrogènes et la croissance des follicules⁶. L’injection de CG humaine (hCG) en substitut de la LH à la fin de la phase folliculaire est utilisée pour stimuler l’ovulation chez l’homme⁷. Les injections de CG sont également utilisées pour traiter l’infertilité humaine, car la CG stimule le corps jaune au début de la grossesse, ce qui entraîne une augmentation de la production de P4. Les injections de prostaglandine F2α (PGF2α) réinitialisent le cycle ovarien⁸. Chez les bovins domestiques, l’injection de PGF2α est utilisée pour raccourcir la phase lutéale et synchroniser le cycle de l’œstrus pour la gestion de la reproduction.

Bien que les ouistitis et les humains aient des mécanismes biologiques similaires, ce qui en fait des animaux modèles idéaux, il y a un manque de littérature décrivant les méthodes de base pour de nombreuses techniques souvent utilisées. Le prélèvement sanguin est l’une des techniques les plus souvent utilisées 9,10,11,12. Cependant, les débutants ont parfois du mal à trouver la veine. Par conséquent, cette étude a effectué des analyses anatomiques de la région de la veine fémorale. Basé sur des observations anatomiques, ce protocole présente la région proximale du triangle fémoral comme un site facile pour la ponction veineuse.

Protocole

Toutes les méthodes impliquant des ouistitis utilisaient des normes éthiques et de bien-être élevées et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre national pour la santé et le développement de l’enfant. Les animaux utilisés ici étaient logés individuellement ou en couple (une femelle et un mâle) avec 12 h de lumière par jour.

1. Prélèvement sanguin de la veine fémorale

1. Préparez une seringue de 1 ml (le type court est facile à utiliser) avec une aiguille de 25 G attachée côté lame vers le haut. Pour éviter l’obstruction du sang, héparinisez la seringue en aspirant 200 μL de solution d’héparine sodique non diluée dans la seringue. Enduisez uniformément l’intérieur de la seringue en la tirant plusieurs fois de haut en bas ; Ensuite, expulsez la solution d’héparine de la seringue.
   REMARQUE : Étant donné qu’il est souvent nécessaire de passer à une nouvelle seringue, préparez quelques seringues héparinées supplémentaires.
2. Préparez des cotons-tiges absorbants et des tampons imbibés d’alcool. Allumez une lampe orientable pour éclairer la zone où le ouistiti sera placé pour le prélèvement sanguin.
3. Préparez le dispositif de retenue (420 x 85 x 85 mm, figure 1A), qui est disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux pour plus de détails). Pour placer un ouistiti dans l’appareil, ouvrez la partie de rétention avec la ceinture éponge, qui sécurise les ouistitis. Insérez le ouistiti dans le dispositif de retenue vers le haut.
   REMARQUE : Les ouistitis sont généralement calmes dans les dispositifs de retenue, ce qui peut annuler la nécessité de s’acclimater ou de s’entraîner à la contention.
4. Capturer le ouistiti ; insérer le ouistiti dans la partie cylindrique ; et fixez-le en appuyant sur la ceinture éponge. Placez la jambe à partir de laquelle le sang doit être prélevé sur l’autre (Figure 1A). Tenez les jambes à l’aide de la main non dominante ; Placez le majeur et l’annulaire à l’intérieur de chaque jambe pour les attacher et les autres doigts à l’extérieur de chaque jambe pour les fixer.
   REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser des gants anti-morsure pour capturer des ouistitis. S’il n’y a pas de dispositif de contention, effectuez un prélèvement sanguin sous anesthésie ou avec une autre personne qui retient le ouistiti.
5. Vérifiez si la veine fémorale est visible près de la base de la cuisse. Si ce n’est pas le cas, palper pour trouver l’artère pulsée et l’utiliser comme point de repère pour vérifier que la veine passe à l’intérieur de celle-ci (Figure 1B-D).
   REMARQUE : L’éclairage du bureau et le rasage des cheveux sont recommandés pour améliorer la visibilité. La visibilité peut également être améliorée en frottant avec des tampons imbibés d’alcool. Les ganglions lymphatiques du triangle sont souvent situés près de la veine et présentent une couleur bleu foncé comme une veine. La façon de les distinguer est décrite dans la section Résultats représentatifs.
6. Désinfectez le site de ponction à l’aide d’un tampon imbibé d’alcool. Insérez l’aiguille côté lame vers le haut à un angle de 15°-20°. Pour éviter que l’aiguille ne glisse hors du vaisseau sanguin lors du prélèvement sanguin, stabilisez la main qui tient la seringue, par exemple en la reposant sur l’autre main.
7. Tirez doucement le piston vers l’arrière pour appliquer une pression négative (Figure 1E). Poussez la pointe de l’aiguille vers l’avant. Une fois que le sang pénètre dans la seringue, maintenez la position de l’extrémité de l’aiguille jusqu’à ce que le volume requis (500-700 μL) ait été prélevé.
   1. Lorsque le sang ne pénètre pas dans la seringue, changez le site de ponction. Si le sang s’écoule lorsque vous retirez l’aiguille, arrêtez le saignement en appliquant une pression sur le site de ponction pendant 3 minutes. Après avoir arrêté le saignement, redémarrez la ponction veineuse.
   2. Si le sang aspiré dans la seringue cesse de circuler pendant le processus de prélèvement, poussez lentement la pointe de l’aiguille vers l’avant, puis tirez-la vers l’arrière pour trouver le vaisseau sanguin. Cela peut rétablir le flux sanguin dans la seringue. Si ce n’est pas le cas, retirez l’aiguille et effectuez la ponction veineuse à l’aide d’une nouvelle seringue.
      REMARQUE : Utilisez la cuisse de l’autre jambe lorsqu’il est difficile de prélever du sang du même côté.
8. Retirez délicatement l’aiguille tout en appuyant légèrement sur le site de ponction à l’aide de l’auriculaire. Ensuite, à l’aide d’un coton-tige absorbant, appliquez immédiatement une pression sur le site de ponction pendant 3 minutes pour arrêter le saignement. Retournez la seringue pour mélanger le sang et l’héparine.
   REMARQUE : Appliquez une pression pendant une période plus longue (5 min) tout en refroidissant lorsque le sang artériel est prélevé, et confirmez soigneusement la fin du saignement pour prévenir la formation d’un hématome, qui peut parfois entraîner une issue fatale.
9. Après avoir confirmé que le saignement a cessé, retirez la ceinture d’éponge, tenez la taille de l’animal d’une main et faites pivoter l’animal de manière à ce que l’on puisse tenir l’aisselle de l’animal avec une autre main de l’arrière.
10. Remettez le ouistiti dans sa cage. Pour réduire le stress et faciliter les prélèvements sanguins répétés, fournissez au ouistiti sa nourriture préférée (par exemple, des biscuits, des guimauves ou une génoise). Vérifiez l’apparition d’un hématome de temps en temps.
    REMARQUE : Lorsque l’hématome est détecté à un stade précoce, appliquez un bandage compressif pour prévenir la progression de l’hématome. Lorsqu’il est détecté après une longue période, l’ablation chirurgicale de l’hématome avec ligature de l’artère fémorale et transfusion sanguine peut être nécessaire ^9,13.
11. Détachez l’aiguille de la seringue pour éviter l’hémolyse. Ensuite, expulsez lentement le sang recueilli le long de la paroi intérieure d’un microtube de 1,5 ml.
    REMARQUE : Le sang collecté peut être stocké à 4 ^oC jusqu’à 24 h avant la séparation du plasma pour mesurer les niveaux de P4/E2.

2. Séparation du plasma et détermination des taux hormonaux

1. Centrifuger le sang dans un tube de 1,5 mL à 1 100 × g pendant 5 min à 4 ^°C.
2. Transférez le plasma séparé (surnageant) du tube de 1,5 mL dans un nouveau tube/gobelet, en évitant soigneusement l’inclusion de cellules sanguines (sédiments).
3. Mesurez les niveaux P4 et E2 à l’aide d’un kit ELISA ou d’un analyseur automatique. Si la quantité de plasma n’est pas suffisante pour l’analyseur automatique, utilisez une solution de dilution de l’échantillon.
   REMARQUE : Pour la mesure à l’aide d’un analyseur automatique, >175 μL de plasma sont nécessaires pour déterminer uniquement un niveau P4, et >250 μL de plasma sont nécessaires pour déterminer à la fois P4 et E2.

3. Mesure de la CG urinaire pour détecter l’ovulation et la grossesse

REMARQUE : Les niveaux de CG chez les ouistitis peuvent être mesurés à l’aide d’un test immunochromatographique pour l’ovulation et la grossesse. Dans le cas de l’ovulation, un résultat positif peut être obtenu 0 à 2 jours avant l’ovulation. Dans le cas d’une grossesse, un résultat positif est détecté entre les jours 15 et 20 jusqu’au 100e jour environ de la grossesse. Le test nécessite une petite quantité (90 μL) d’urine (une goutte d’urine équivaut à ~30 μL).

1. Méthode du plateau : Si plus de deux animaux se trouvent dans la même cage, déplacez le ouistiti cible (ou les autres animaux) dans une autre cage la veille. Placez un plateau propre au fond de la cage la veille ou avant l’allumage. L’urine n’est pas évacuée de la vessie pendant la nuit. Par conséquent, l’urine est généralement libérée de la vessie peu de temps après l’allumage.
   REMARQUE : Entrer dans la pièce le matin avant l’éclairage peut perturber le cycle de sommeil de la cohorte. L’urine peut généralement être recueillie dans les 30 minutes environ suivant l’allumage.
2. Méthode de pressage : Préparez les plateaux lavés pour la collecte de l’urine. Après avoir localisé la vessie du ouistiti, pressez-la soigneusement de l’avant et des deux côtés sur toute la longueur des doigts (figure 1F). Prélevez l’urine juste avant d’éclairer la pièce le matin.
   REMARQUE : Si le prélèvement d’urine échoue en raison de l’absence d’urine dans la vessie, attendez un moment et réessayez. Attention à ne pas utiliser une force excessive car cela blesserait l’animal.
3. Immédiatement après le prélèvement, placez l’échantillon d’urine dans le puits du kit de test immunochromatographique. Lisez le résultat après 10 minutes selon les instructions du fabricant.

4. Contrôle et détermination du stade du cycle ovarien pour la collecte d’ovocytes, de zygotes et d’embryons

1. Prélèvement d’ovocytes de la vésicule germinale (GV) dans les ovaires
   1. Administrer une injection intramusculaire de 3 μL de cloprosténol à 0,263 mg/mL (un analogue synthétique du PGF2α) dilué dans 150 μL de solution saline¹⁴ (figure 2) pour réinitialiser le cycle ovarien à la fin de la phase lutéale (c’est-à-dire ≥10 jours après le début de la phase lutéale).
      REMARQUE : Préparer la solution diluée dans un plus grand volume peut être pratique car le cloprosténol dilué reste stable pendant au moins plusieurs semaines à +4 °C.
   2. Le lendemain (jour 1), confirmez l’initiation de la phase folliculaire en vérifiant que le taux de P4 a chuté.
      REMARQUE : Il a été rapporté que l’injection de cloprosténol diminue considérablement les niveaux de P4 (généralement <10 ng/mL) en 24 h³.
   3. À partir du jour 1, injectez de la FSH (25 UI, par voie intramusculaire) une fois tous les 2 jours pour un total de 5x (jours 1, 3, 5, 7 et 9). Le 10e jour, injecter de l’hCG (75 UI, par voie intramusculaire) dans l’après-midi.
   4. Prélever les GV des ovaires le 11e jour par aspiration folliculaire sous anesthésie selon la littérature^15,16.
      REMARQUE : Parfois, l’ovulation se produit plus tôt que prévu. Ainsi, il est recommandé de vérifier les niveaux de CG à partir du jour 8. Si le test CG est positif, effectuez le prélèvement GV ce jour-là.
2. Collecte d’ovocytes, de zygotes et d’embryons précoces en métaphase II (MII)
   1. Réinitialisez le cycle ovarien à l’aide de cloprosténol comme décrit à l’étape 4.1.1.
   2. Le lendemain (jour 1), confirmez l’initiation de la phase folliculaire en vérifiant que le taux de P4 a chuté.
   3. Pour la collecte de zygotes et d’embryons, hébergez des ouistitis femelles avec des ouistitis mâles pour l’accouplement à partir du 6e jour.
   4. À partir du jour 7, vérifiez les taux sanguins de P4/E2 et les niveaux de CG urinaire des femelles. La détection de la CG est une indication de l’ovulation en quelques jours (généralement le lendemain). Le jour où les niveaux de P4 augmentent et les niveaux d’E2 diminuent par rapport à la veille, prélever les ovocytes MII ou les zygotes embryonnaires du jour 0 (E0) des oviductes^17,18.
   5. Pour le prélèvement d’embryons, tel que décrit dans la littérature, effectuer le rinçage soit des oviductes (E1-E3, 1-8 cellules)^17,18, soit de l’utérus (E5-E10, 8 cellules-blastocyste)19,20,21,22 au moment approprié, en fonction du stade ciblé.

Résultats

Le tableau 1 donne des précisions sur les animaux utilisés dans cette étude.

Analyses anatomiques de la veine fémorale
Des analyses anatomiques de la veine fémorale ont été effectuées à l’aide d’un ouistiti commun mâle de 2 ans (I 7713M) euthanasié. Les veines et les artères fémorales sont situées dans le triangle fémoral. Le triangle fémoral se forme à la limite entre la paroi abdominale et les muscles...

Discussion

La localisation de la veine est l’étape la plus critique dans la collecte de sang. Basé sur des observations anatomiques, ce protocole présente la zone proximale dans le triangle fémoral comme un site facile pour la collecte de sang chez les ouistitis. En utilisant cette zone, le prélèvement sanguin d’une grosse veine peut être facilement effectué. Cependant, même en utilisant ce protocole, des lésions à une artère se produisent parfois. Lors d’une blessure à une artè...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AIA-360	Tosoh Corporation	0019945	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATE	Tosoh Corporation	0020956	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK SUBSTRATE SET II	Tosoh Corporation	0020968	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK WASH CONCENTRATE	Tosoh Corporation	0020955	Hormone measurement (P4/E2)
CMS-1	CLEA Japan		Marmoset food
Estrumate	MSD Animal Health		PGF2alpha analog (cloprostenol)
Gonal-f Subcutaneous Injection 150	Merck Biopharma Co., Ltd.		FSH
Gonatropin for intramuscular injection 1000	ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.	872413	hCG
Heparin sodium injection solution 5,000 units/5 mL	Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.	224122458	Blood collection
Immunochromatographic Test Kit for Detection of Common Marmoset Chorionic Gonadotropin (Dual Checker)	CLEA Japan, Inc.		Determining CG level
Low-profile double-arm microscope illumination LPF-SD	SHIOKAZE GIKEN		Desk lamp for blood collection
Marmoset blood collection restraint device	JIC Japan	JM-1006	Blood collection http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html email: vi@jic-japan.jp
Metacam 0.05%	Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd.		Hematoma treatment
Sample Cup, 3 mL, PS, for Tosoh 360 and AIA-600 II, 1000/Bag	Globe Scientific	110913	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2	Tosoh Corporation	0025224	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 CALIBRATOR SET	Tosoh Corporation	0025324	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTION	Tosoh Corporation	0025524	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII	Tosoh Corporation	0025240	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRATOR SET	Tosoh Corporation	0025340	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTION	Tosoh Corporation	0025540	Hormone measurement (P4/E2)
Syringe with 25 G (0.50 x 25 mm) needle	TERUMO	SS-01T2525	Blood collection
Tensolvet 5.000 I.E. gel.	Dechra Pharmaceuticals	14033492	Hematoma treatment
TOSOH MULTI-CONTROL SET	Tosoh Corporation	0015965	Hormone measurement (P4/E2)