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Accès à la différenciation précoce des lymphocytes T CD4+ auxiliaires folliculaires spécifiques du virus chez les souris infectées par le LCMV aigu
* Ces auteurs ont contribué à parts égales
Dans cet article
Résumé
L’étude actuelle présente des protocoles permettant d’évaluer l’engagement précoce du devenir des cellules TFH spécifiques du virus et de manipuler l’expression génique dans ces cellules.
Résumé
Les lymphocytes T auxiliaires folliculaires (TFH) sont perçus comme une lignée de lymphocytes T CD4+ indépendante qui aide les lymphocytes B apparentés à produire des anticorps de haute affinité, établissant ainsi une immunité humorale à long terme. Au cours d’une infection virale aiguë, l’engagement du destin des lymphocytes TFH spécifiques du virus est déterminé au début de la phase d’infection, et l’étude des lymphocytes TFH différenciés précocement est cruciale pour comprendre l’immunité humorale dépendante des lymphocytes T et optimiser la conception du vaccin. Dans l’étude, à l’aide d’un modèle murin d’infection par le virus de la chorioméningite lymphoïde aiguë (LCMV) et de la souris SMARTA (SM) transgénique TCR avec des lymphocytes T CD4+ reconnaissant spécifiquement l’épitope de la glycoprotéine LCMV I-AbGP66-77, nous avons décrit des procédures permettant d’accéder à l’engagement précoce du devenir des cellules TFH spécifiques du virus sur la base de colorations par cytométrie en flux. De plus, en exploitant la transduction rétrovirale des lymphocytes T SM CD4+ , des méthodes permettant de manipuler l’expression génique dans les lymphocytes TFH spécifiques du virus différenciés précocement sont également fournies. Par conséquent, ces méthodes aideront aux études explorant le(s) mécanisme(s) sous-jacent(s) à l’engagement précoce des cellules TFH spécifiques du virus.
Introduction
Lorsqu’ils rencontrent différents agents pathogènes ou menaces, les lymphocytes T CD4+ naïfs adaptent leurs réponses immunitaires en se différenciant en divers sous-ensembles de lymphocytes T auxiliaires (TH) dotés de fonctions spécialisées1. Dans le scénario d’une infection virale aiguë, une grande partie des lymphocytes T CD4+ naïfs se différencient en lymphocytes T auxiliaires folliculaires (TFH) qui aident les lymphocytes B 2,3. Distinctes des autres sous-ensembles de cellules TH CD4+ (p. ex., cellules TH1,....
Protocole
Toutes les expériences sur les animaux ont été menées selon des procédures approuvées par les comités institutionnels de soin et d’utilisation des animaux de la troisième université de médecine militaire. Les souches de souris suivantes ont été utilisées dans la présente étude : souris C57BL/6J (B6) (des deux sexes), âgée de 6 à 8 semaines, pesant de 25 à 30 g ; souris transgéniques CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgéniques), des deux sexes, âgées de 6 à 8 semaines, pesant de 25 à 30 g ; et souris transgénique CXCR5-GFP CD45.1+SM TCR (B6 CD45.1 × SM TCR transgénique × CXCR5-GFP knock-in), des deux sexes, âgées de 6 à 8 semaines, pesant de 2....
Résultats Représentatifs
Caractéristiques des lymphocytes TFH spécifiques du virus différenciés précocement au cours d’une infection aiguë par le LCMV
Afin de sonder l’engagement précoce des lymphocytes TFH spécifiques du virus, des lymphocytes T congéniques SM CD4+ naïfs qui reconnaissent spécifiquement l’épitope I-AbGP66-77 du LCMV ont été transférés adoptivement chez des receveurs CD45.2+ C57BL/6. Le lendemain, ces receveurs ont été i.......
Discussion
La recherche dans le domaine des lymphocytes TFH a été mise en évidence depuis la découverte de la fonction spécialisée des lymphocytes TFH dans l’aide aux lymphocytes B. De plus en plus d’études ont indiqué que la différenciation des cellules TFH est un processus en plusieurs étapes et multifactoriel30, dans lequel l’engagement du destin des cellules TFH est déterminé à un stade précoce5. Par conséquent, une .......
Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Remerciements
Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 32300785 à X.C.), du Programme national postdoctoral de Chine pour les talents innovants (n° 100). BX20230449 à X.C.) et le Grand projet national en sciences et technologie (n° 2021YFC2300602 à L.Y.).
....matériels
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA | Beyotime | P0099-500mL | |
| 70 μm cell strainer | Merck | CLS431751 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1) | Biolegend | 127812 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20) | Biolegend | 110724 | 1:200 dilution |
| APC anti-mouse CD25 (clone PC61) | Biolegend | 101910 | 1:200 dilution |
| B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BeaverBeads Streptavidin | Beaver | 22321-10 | |
| Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8) | Biolegend | 123106 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418) | Biolegend | 117304 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136) | Biolegend | 108704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119) | Biolegend | 116204 | 1:200 dilution |
| bovine serum albumin, BSA | Sigma | A7906 | |
| Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10) | Biolegend | 644816 | 1:100 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12) | Biolegend | 135220 | 1:200 dilution |
| C57BL/6J (B6) mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CXCR5-GFP knock-in reporter mouse | In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5. | ||
| DMEM 10% medium | DMEM medium containing 10% FBS | ||
| DMEM medium | Gibco | 11885092 | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| FACSFortesa | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum, FBS | Sigma | F8318 | |
| FlowJo (version 10.4.0) | BD Biosciences | ||
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer. |
| Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated | Vector laboratories | BA-9400-1.5 | 1:200 dilution |
| Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | ||
| Isolation buffer | FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
| LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV) | Chinese Peptide Company | ||
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | 1:200 dilution |
| MigR1 | addgene | #27490 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Opti-MEM medium | Gibco | 31985070 | |
| pCL-Eco | addgene | #12371 | |
| PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3) | Biolegend | 104508 | 1:200 dilution |
| PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91) | BD Biosciences | 561522 | 1:50 dilution |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010072 | |
| Polybrene | Solarbio | H8761 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8) | BD Biosciences | 551961 | 1:50 dilution |
| Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5) | Biolegend | 100538 | 1:200 dilution |
| recombinant murine IL-2 | Gibco | 212-12-1MG | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Beyotime | C3702-500mL | |
| RPMI 1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI 2% | RPMI 1640 medium containing 2% FBS | ||
| SMARTA (SM) TCR transgenic mouse | SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450). | ||
| Staining buffer | PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3 | ||
| Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | 1:200 dilution |
| TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) | Cell signaling technology | 6444S | 1:400 dilution |
| TFH cell staining buffer | FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum | ||
| TransIT-293 reagent | Mirus Bio | MIRUMIR2700 |
Références
- O'shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of di....
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