Dissociation d’échantillons de tissus tumoraux humains et murins pour le séquençage d’ARN unicellulaire

Résumé

Ce protocole décrit la procédure de dissociation rapide des échantillons de tumeurs humaines et de souris pour le séquençage de l’ARN sur cellule unique.

Résumé

Les échantillons de tumeurs humaines contiennent une pléthore d’informations sur leur microenvironnement et leur répertoire immunitaire. La dissociation efficace d’échantillons de tissus humains en suspensions cellulaires viables est une donnée d’entrée nécessaire pour le pipeline de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq). Contrairement aux approches de séquençage de l’ARN en vrac, le scRNAseq nous permet de déduire l’hétérogénéité transcriptionnelle dans les échantillons tumoraux au niveau de la cellule unique. L’intégration de cette approche au cours des dernières années a conduit à de nombreuses découvertes, telles que l’identification d’états cellulaires immunitaires et tumoraux et de programmes associés aux réponses cliniques aux immunothérapies et à d’autres types de traitements. De plus, les technologies unicellulaires appliquées aux tissus dissociés peuvent être utilisées pour identifier les régions de chromatine accessibles, le répertoire des récepteurs des lymphocytes T et B, et l’expression des protéines, à l’aide d’anticorps à code-barres d’ADN (CITEseq).

La viabilité et la qualité de l’échantillon dissocié sont des variables critiques lors de l’utilisation de ces technologies, car elles peuvent affecter considérablement la contamination croisée de cellules uniques avec de l’ARN ambiant, la qualité des données et l’interprétation. De plus, les protocoles de dissociation longs peuvent conduire à l’élimination de populations cellulaires sensibles et à la régulation positive d’une signature génique de réponse au stress. Pour surmonter ces limitations, nous avons conçu un protocole de dissociation universelle rapide, qui a été validé sur plusieurs types de tumeurs humaines et murines. Le processus commence par une dissociation mécanique et enzymatique, suivie d’une filtration, d’une lyse des globules rouges et d’un enrichissement des cellules mortes vivantes, ce qui convient aux échantillons à faible apport de cellules (par exemple, les biopsies à l’aiguille). Ce protocole garantit une suspension unicellulaire propre et viable, essentielle à la génération réussie d’émulsions de billes de gel (GEM), de codes-barres et de séquençage.

Introduction

Bien que de nombreuses avancées dans la recherche sur le cancer aient conduit au développement et à l’approbation par la FDA d’agents ciblant les récepteurs inhibiteurs exprimés sur les cellules immunitaires et tumorales, connus sous le nom d’inhibiteurs de blocage de points de contrôle, la résistance au traitement et l’identification des mécanismes qui déterminent la réponse des patients restent difficiles¹. Le défi complexe de caractériser l’hétérogénéité tumorale sur sa diversité moléculaire et l’interaction complexe entre les cellules tumorales et le microenvironnement immunitaire nécessite de nouvelles approches pour disséquer cet écosystè....

Protocole

Cette étude a respecté toutes les directives institutionnelles concernant l’échantillonnage de tissus humains. Le consentement éclairé des patients a été reçu et les données identifiables de l’échantillon ont été anonymisées. Les échantillons sont prélevés dans la salle d’opération, placés dans une solution de RPMI, de sérum physiologique ou de PBS, et confirmés cancéreux par le service de pathologie avant d’être utilisés dans la recherche. Toutes les étapes, sauf indication contraire, doivent être effectuées à 4 °C ou sur glace. Travaillez à l’intérieur d’une cagoule de biosécurité lors du traitement de tissus humains. Voir le tableau des matériaux p....

Discussion

Ce protocole décrit la dissociation d’échantillons tumoraux humains ou murins en une suspension unicellulaire pour le séquençage de l’ARNsc à l’aide du système microfluidique 10x Genomics. Lors du traitement de tissus qui proviennent souvent de cancers rares ou qui font partie d’essais cliniques en cours ou de longues expériences pour des tumeurs murines, l’échantillon doit être conservé de manière optimale et soigneuse entre toutes les étapes. Toutes les étapes doivent être effectuées rapidement.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Corning	21-040-CV
10 mL serological pipette	Corning	357551
1000 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389213
1000 μL low-retention wide pipette tips	Rainin	30389218
1000 μL pipette tips	Rainin	30389212
10x Magnetic Separator	10x Genomics	120250
15 mL conical tubes	Corning	430052
2 mL aspirating pipette	Corning	357558
20 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389226
20 μL pipette tips	Rainin	30389225
200 μL low-retention pipette tips	Rainin	30389240
200 μL pipette tips	Rainin	30389239
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352098
60 x 15 mm Tissue Culture Dish	Falcon	353004
ACK Lysing Buffer	Gibco	A10492-1
BD 1 mL syringe	Becton, Dickinson and Company	3090659
Bright-Line Hemocytometer	Hausser Scientific	551660
Calcium Chloride Solution	Sigma Aldrich	2115-100ML
Cell Ranger	10x Genomics	N/A	https://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
Cell counting slides for TC20 cell counter	Bio-Rad	1450015
CellTrics 30μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2326
CellTrics 50μm sterile disposable filters	Sysmex	04-004-2327
Dead Cell removal Kit	Miltenyi Biotec	130-090-101	Store at -20 °C; kit 2
Dissecting Forceps, Fine Tip	VWR	82027-386
DNA LoBind Microcentrifuge tubes, 1.5 mL	Eppendorf	22431021
EasySepTM Dead Cell Removal (Annexin V) Kit	STEMCELL Technologies	17899	Store at 4 °C; Kit 1
Eppendorf centrifuge 5425R	Eppendorf	5406000640
Eppendorf centrifuge 5910R	Eppendorf	2231000657
Eppendorf Easypet 3 Electronic Pipette controller	Eppendorf	EP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5 Model 5384	Eppendorf	EP5384000012
FBS	Gibco	26140-079	Store at 4 °C, use in a Biological hood
German Stainless Scissors	Fine Science Tools	14568-12
Leica Dmi1 Microscope	Leica Microsystems	454793
LS Column	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS Multistand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Rainin	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Rainin	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Rainin	17014392
Quadro MACS Magnet	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)	Gibco	21870-076	Store at 4 °C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube strips	USA Scientific	1402-4700
Trypan blue stain 0.4%	Thermo Fisher Scientific	T10282
Tumor Dissociation Kit, Human	Miltenyi Biotec	130-095-929	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme H vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
Tumor Dissociation Kit, Mouse	Miltenyi Biotec	130-096-730	Store at -20 °C, prepare enzymes according to kit instructions: Reconstitute lyophilized Enzyme D vial in 3 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme R vial in 2.7 mL of RPMI 1640 Reconstitute lyophilized Enzyme A vial in 1 mL of Buffer A supplied with the kit.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Store at 4 °C