Pipeline pour l’étude anatomique tridimensionnelle multi-échelle du cœur humain

Résumé

Ce protocole présente un pipeline complet pour analyser des échantillons obtenus à partir de cœurs humains qui couvrent les échelles microscopique et macroscopique.

Résumé

L’étude détaillée des cœurs humains non défaillants rejetés pour la transplantation offre une occasion unique d’effectuer des analyses structurelles à des échelles microscopiques et macroscopiques. Ces techniques comprennent l’élimination des tissus (imagerie tridimensionnelle (3D) modifiée par immunomarquage des organes éliminés par solvant) et la coloration immunohistochimique. Les procédures d’examen mésoscopique comprennent la dissection stéréoscopique et la tomodensitométrie (TDM). Les procédures d’examen macroscopique comprennent la dissection macroscopique, la photographie (y compris les anaglyphes et la photogrammétrie), la tomodensitométrie et l’impression 3D du cœur disséqué physiquement ou virtuellement ou entier. Avant l’examen macroscopique, une fixation par perfusion de pression peut être effectuée pour maintenir l’architecture 3D et la morphologie physiologiquement pertinente du cœur. L’application combinée de ces techniques à l’étude du cœur humain est unique et cruciale pour comprendre la relation entre des caractéristiques anatomiques distinctes telles que la coronaroplastie et l’innervation myocardique dans le contexte de l’architecture 3D du cœur. Ce protocole décrit les méthodologies en détail et comprend des résultats représentatifs pour illustrer les progrès de la recherche sur l’anatomie cardiaque humaine.

Introduction

Comme la fonction suit la forme, la compréhension de l’architecture du cœur est fondamentale pour apprécier sa physiologie. Bien que de nombreuses recherches aient révélé l’anatomie cardiaque à l’échelle microscopique ^1,2,3, de nombreuses questions restent en suspens, en particulier celles liées à l’anatomie cardiaque humaine. Cela s’explique en partie par le fait que les études fondamentales axées sur l’anatomie fonctionnelle ont généralement utilisé des cœurs d’animaux ^4,5,6, qui sont souvent distincts des cœurs humains ^1,7,8. De plus, chaque étude individuelle, même celles utilisant des échantillons de cœur humain, a tendance à se concentrer sur des structures très spécifiques, ce qui rend difficile l’application des résultats dans le contexte de l’ensemble du cœur. C’est encore plus vrai si les structures focalisées se trouvent à des échelles micro ou mésoscopiques, comme le perinexus⁹ et les plexus ganglionnaires¹⁰.

Dans ce contexte, l’étude structurale systémique du cœur humain rejeté pour la transplantation offre une occasion unique et rare d’obtenir un atlas complet des structures cardiaques en mettant l’accent sur les échelles microscopiques et macroscopiques¹¹. Les protocoles d’examen microscopique comprennent l’élimination des tissus (imagerie tridimensionnelle (3D) modifiée des organes éliminés par immunomarquage, iDISCO+^)12,13 et la coloration immunohistochimique. Les protocoles d’examen mésoscopique comprennent la dissection stéréoscopique, la macrophotographie et la tomodensitométrie (TDM). Les protocoles d’examen macroscopique comprennent la dissection macroscopique¹⁴, la photographie (y compris les anaglyphes et la photogrammétrie)15,16,17, la tomodensitométrie, la dissection virtuelle ¹⁸ et l’impression 3D du cœur disséqué physiquement ou virtuellement ou du cœur entier¹⁷. En préparation à l’examen macroscopique, une fixation par perfusion de pression est effectuée pour maintenir l’architecture 3D et la morphologie physiologiquement pertinente du cœur 14,19,20,21. L’application combinée de ces techniques est unique et cruciale pour corréler des caractéristiques anatomiques distinctes dans le contexte de l’architecture 3D du cœur humain.

Comme la possibilité d’obtenir un échantillon de cœur humain non pathologique est extrêmement limitée, une approche multi-échelle décrite dans le présent document maximise l’utilisation de l’échantillon. En appliquant les différentes procédures décrites ci-dessous, des résultats représentatifs illustreront au lecteur comment les résultats peuvent être utilisés à des fins multiples, y compris la découverte dans la recherche scientifique¹¹ (analyses complètes de l’innervation cardiaque, de la distribution des plexus ganglionnaires), l’amélioration des procédures cliniques (simulation pour les approches chirurgicales et interventionnelles) et l’éducation anatomique (démonstration 3D réelle de l’anatomie cardiaque).

Protocole

Cette étude a utilisé des échantillons de tissus anonymisés prélevés sur des cœurs humains de donneurs non défaillants et a été approuvée par le conseil d’examen institutionnel de l’Université de Californie à Los Angeles (UCLA). Des échantillons ont été prélevés à partir de cœurs non défaillants qui ont été rejetés pour la transplantation. Les cœurs ont été perfusés sous pression, fixés dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % et imagés avant le traitement des tissus selon les méthodes suivantes. La figure 1 résume l’organigramme de l’ordre de l’étude. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Examen à l’échelle microscopique

1. Nettoyage tissulaire à l’aide de l’imagerie 3D modifiée d’organes clairsemés par immunomarquage (protocole iDISCO+).
   1. Disséquez du tissu fixé à 4 % de PFA à l’aide d’un scalpel pour l’adapter à la chambre de 3 mm × 16 mm × 25 mm pour la microscopie confocale. Pour imager des tissus plus épais, des chambres et/ou des espaceurs supplémentaires peuvent être empilés sur la lame.
   2. Déshydrater les échantillons à l’aide de la série de méthanol gradué (MeOH) (20 %, 40 %, 60 %, 80 % et 100 % MeOH dans du H₂O désionisé [vol/vol]) pendant 1 h chacun à température ambiante (RT) avec agitation.
   3. Laver avec 100% de MeOH pendant 1 h à RT et immerger dans 66% de dichlorométhane/33% de MeOH à RT avec agitation pendant la nuit.
   4. Le lendemain, laver deux fois au MeOH (100%) pendant 1 h à RT, réfrigérer à 4 °C et traiter à 5% H₂O₂ in MeOH (vol/vol) pendant la nuit à 4 °C.
   5. Réhydratez-vous avec les séries MeOH graduées (80 %, 60 %, 40 % et 20 % MeOH) et lavez à 0,01 mol/L PBS pendant 1 h chacun à RT avec agitation.
   6. Laver les mouchoirs deux fois dans du PBS 0,01 mol/L avec 0,2 % de Triton X-100 pendant 1 h à RT.
   7. Préparez-vous à l’immunomarquage par perméabilisation dans 0,01 mol/L de PBS, 20 % de diméthylsulfoxyde (DMSO), 0,2 % de Triton X-100 et 0,3 mol/L de glycine pendant 2 jours à 37 °C avec agitation.
   8. Bloquer dans 0,01 mol/L de PBS avec 10 % de DMSO, 0,2 % de Triton X-100 et 5 % de sérum d’ânesse normal pendant encore 2 jours à 37 °C avec agitation.
   9. Marquage avec un anticorps primaire compatible avec le MeOH conjugué à des fluorophores dilués dans 0,01 mol/L de PBS avec 10 mg/mL d’héparine (PTwH), 0,2 % de Tween-20, 5 % de DMSO et 3 % de sérum d’âne normal pendant 3 à 4 jours à 37 °C avec agitation.
   10. Réapprovisionnez la solution d’anticorps et incubez pendant encore 3 à 4 jours à 37 °C en agitant.
   11. Après 1 semaine d’incubation dans une solution d’anticorps primaires, laver 4 à 5 fois dans PTwH pendant la nuit à RT.
   12. Incuber avec des anticorps secondaires conjugués à des fluorophores dilués dans du PTwH, 3% de sérum d’âne normal pendant 3 jours à 37 °C avec agitation.
   13. Réapprovisionnez la solution d’anticorps secondaires, incubez pendant encore 3 jours à 37 °C en agitant.
   14. Après une incubation de 6 jours dans une solution secondaire d’anticorps, laver dans PTwH 4 à 5 fois pendant la nuit à RT.
   15. Déshydrater avec une série MeOH graduée (20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 % et 100 % MeOH). L’échantillon peut être stocké pendant la nuit à RT.
   16. Incuber dans 66% de dichlorométhane/33% de MeOH pendant 3 h à la RT avec agitation.
   17. Laver deux fois au 100% de dichlorométhane pendant 15 min à RT avec agitation.
   18. Incuber et stocker les échantillons dans de l’éther benzylique. Remplissez le tube pour minimiser l’oxydation de l’échantillon par l’air.
2. Imagerie d’un échantillon nettoyé des tissus
   1. Fixez une chambre contenant de l’adhésif sur une lame et appliquez du vernis à ongles sur le pourtour de la chambre. Pour les tissus plus épais, des chambres et/ou des entretoises supplémentaires peuvent être empilées sur la lame.
   2. Placez le mouchoir transparent dans la chambre, remplissez-le d’éther benzylique et appliquez une lamelle.
   3. Appliquez du vernis à ongles autour de la lamelle pour créer une étanchéité.
   4. Obtenez des images tilescan et Z stack à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser vertical avec un objectif 5x ou 10x pour imager à une profondeur allant jusqu’à la distance de travail de l’objectif.
   5. Image à une résolution de 1024 x 1024 en utilisant des raies laser appropriées pour les spectres d’émission des fluorophores utilisés. L’autofluorescence musculaire est visible à l’aide de la ligne laser de 488 nm.
   6. Assurez-vous que la taille du pas de l’axe z est proportionnelle à l’échantillonnage de Nyquist basé sur l’ouverture numérique de l’objectif¹¹ spécifié.
   7. Assemblez des images et utilisez un logiciel de visualisation 3D.
   8. Créez des figures à l’aide d’images de projection d’intensité maximale (MIP) d’empilements Z pour des canaux individuels et fusionnés (Figure 2).
3. Immunohistochimie
   REMARQUE : Une fois que le tissu est inclus dans la paraffine²², la procédure suivante est utilisée pour créer des lames pour l’étude immunohistochimique.
   1. Préparation de la solution d’adaptation de l’indice de réfraction (RIMS).
      1. Préparez un tampon phosphate de 0,1 mol/L en ajoutant 10,9 g de Na₂HPO₄ (anhydre) et 3,1 g de NaH₂PO₄ (monohydraté) à du H₂O désionisé pour obtenir un volume total de 1 L (pH 7,4). Filtrez-stérilisez la solution et conservez-la à RT.
      2. Diluer le tampon phosphate à 0,02 mol/L.
      3. Dissoudre Histodenz dans 30 mL de tampon phosphate à 0,02 mol/L en agitant la solution pendant 10 minutes avec une barre d’agitation magnétique dans le dernier flacon de stockage qui peut être scellé pour minimiser l’évaporation et la contamination.
      4. Ajoutez de l’azoture de sodium à une concentration totale de 0,01 % (p/v) et ajustez le pH à 7,5 avec du NaOH.
      5. Ajustez l’IR en faisant varier la concentration finale d’Histodenz.
      6. Stockez le RIMS chez RT pendant des mois. Jeter si une contamination microbienne est constatée.
         REMARQUE : Ne pas autoclaver des solutions contenant de l’azoture de sodium.
   2. Préparation de lames pour l’étude immunohistochimique
      1. Créez des sections de 5 μm d’épaisseur avec un microtome. Appliquez une section de tissu sur les lames chargées.
      2. Retirer la paraffine en incubant les lames dans du xylène à >75 % pendant 10 min. Déplacer les lames dans un deuxième contenant contenant du xylène pendant 10 minutes supplémentaires.
      3. Retirez le xylène en immergeant les lames dans 100% d’EtOH pendant 10 min, puis dans 95% d’EtOH pendant 5 min et 70% d’EtOH pendant 5 min.
      4. Rincez les lames avec du H₂O déminéralisé pendant 5 min.
      5. Immerger les lames dans le tampon de récupération d’antigène pendant 25 min à 90-95^°C.
      6. Laisser refroidir le récipient à RT pendant 1 h en agitant.
      7. Immergez les lames dans un tampon de trempage (0,01 mol/L PBS + 0,4 % Triton X-100) pendant 30 min à 4^°C.
      8. Encerclez le tissu avec un stylo PAP. Ajoutez du PBS à chaque lame et placez-la dans une chambre humidifiée pour éviter la dessiccation.
      9. Laver les lames avec PBS à RT avec agitation pendant 5 min.
      10. Bloc avec tampon bloquant (0,01 mol/L PBS + 10% sérum d’ânesse + 0,1% TX-100) pendant 1 h avec agitation.
      11. Incuber avec un anticorps primaire dilué dans un tampon de blocage pendant la nuit à 4^°C.
      12. Le lendemain, laissez les diapositives se réchauffer à RT pendant 15 min.
      13. Lavez les lames 3 fois avec 0,01 mol/L de PBS + 0,2 % de TritonX-100 pendant 5 min.
      14. Incuber avec un anticorps secondaire dilué dans un tampon de blocage pendant 1 h à RT avec agitation.
      15. Lavez les lames 3 fois avec 0,01 mol/L de PBS + 0,2 % de TritonX-100 pendant 5 min.
      16. Lavez les lames 3 fois avec 0,01 mol/L de PBS pendant 5 min.
      17. Placez 1 goutte de RIMS à l’aide d’un compte-gouttes et appliquez une lamelle.
      18. Appliquez du vernis à ongles autour de la lamelle pour créer l’étanchéité.
      19. En tant que témoin négatif, prélevez un échantillon sans l’anticorps primaire pour démontrer l’absence de coloration spécifique.
   3. Imagerie de lames immunomarquées
      1. Imagez les lames à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser avec des objectifs 10x, 20x et 40x.
      2. Image à une résolution de 1024 x 1024 à l’aide de raies laser appropriées pour les spectres d’émission des anticorps secondaires utilisés.
      3. Créez des figures à l’aide d’images de projection d’intensité maximale (MIP) d’empilements Z pour des canaux individuels et fusionnés (Figure 3).

2. Examen à méso-échelle

1. Dissection stéréoscopique
   1. Effectuez des dissections délicates en se concentrant sur des structures minuscules ou minces, telles que le nœud auriculo-ventriculaire, l’artère du ganglion auriculo-ventriculaire et le plexus nerveux cardiaque (échelle submillimétrique à millimétrique) avec une lampe de bureau loupe avec pince, des télescopes chirurgicaux ou un stéréomicroscope.
2. Balayage Micro-CT
   REMARQUE : L’imagerie par tomodensitométrie est réalisée après la perfusion sous pression et la fixation et à tous les stades de la dissection à l’aide d’un scanner par tomographie par émission de micropositons (TEP)/TDM (Figure 4).
   1. Réchauffez la source de rayons X CT pendant 25 minutes avant l’imagerie de l’échantillon.
   2. Placez l’échantillon de cœur sur le lit du scanner.
   3. Déplacez le lit du scanner en position horizontale de 544 mm et en position verticale de 14 mm pour centrer le cœur dans le champ de vision de la tomodensitométrie.
   4. Acquisition d’images CT à 80 kVp, 150 μA, avec 720 projections pendant 1 min de balayage à une résolution spatiale de 200 μm.
   5. Reconstruisez les données CT avec un champ de vision de 12 cm x 12 cm x 10 cm et une matrice de 600 x 600 x 500 voxels, et enregistrez-les en tant que fichier DICOM.

3. Examen à grande échelle

1. Perfusion et fixation sous pression
   REMARQUE : Les auteurs modifient les techniques de perfusion et de fixation par pression précédemment décrites et les appliquent aux cœurs humains non défaillants rejetés pour la transplantation 14,19,20,21.
   1. Utilisez des pompes à haut débit pour la fixation de la perfusion. Utilisez soit de l’éthanol^{à 100} %, du PFA à 4 % ou du formol à 10 % pour le fixateur.
      REMARQUE : Le cœur est récupéré avec l’aorte ascendante, le tronc pulmonaire et la veine cave et les veines pulmonaires réséqués aussi distalement que possible et délivrés dans la solution²³ de l’Université du Wisconsin.
   2. Utilisez deux canules chirurgicales de 20-24 Fr pour la perfusion cardiaque droite et gauche. Pour la perfusion du cœur droit, canulez la veine cave supérieure et placez un évent au niveau du tronc pulmonaire ou de l’artère pulmonaire avec des seringues en plastique demi-coupées de 12 à 30 ml avec des embouts Luer-Lock fixés à des robinets d’arrêt à trois voies.
   3. Occlure la veine cave inférieure et l’autre artère pulmonaire avec de la ficelle après avoir mis une seringue en plastique demi-coupée verrouillée de taille appropriée ou un tube à centrifuger de 1,5 à 5,0 ml.
      1. Pour la perfusion antérograde du cœur gauche, canuler l’une des veines pulmonaires et placer un évent à l’extrémité distale coupée de l’aorte avec les seringues en plastique demi-coupées de 12 à 30 ml avec des embouts Luer-Lock fixés à des robinets d’arrêt à trois voies.
      2. Pour une perfusion rétrograde du cœur gauche, canulez l’une des branches de l’arc aortique et placez un évent sur une autre branche de l’arc aortique. Placez les extrémités des canules dans les deux ventricules.
   4. Obstruez les autres orifices vasculaires à l’aide d’une ficelle après avoir inséré une seringue en plastique demi-coupée verrouillée de taille appropriée ou un tube de microcentrifugation de 1,5 à 5,0 ml. Utilisez une gaze fine pour couvrir la partie d’insertion des seringues/tubes/canules afin d’éviter les fuites et les glissades. Réparez les fuites importantes à l’aide de sutures, de bandes ou d’agglomérations. Les petites fuites sont autorisées.
   5. Suspendez le cœur dans un récipient en plastique.
   6. Connectez un tube en plastique souple 22-24 Fr à chaque canule et insérez l’autre extrémité du tube dans le récipient rempli de fixateur.
   7. Faire circuler le fixateur dans les circuits du cœur droit et du cœur gauche à l’aide d’une pompe à haut débit réglée à environ 100-300 ml/min pour le cœur droit et 200-400 mL/min pour le cœur gauche afin d’atteindre environ 20 mmHg dans le ventricule droit et 80 mmHg dans le ventricule gauche, respectivement.
   8. Maintenir la perfusion à 4 °C pendant 24 h.
   9. Lavez le cœur avec 0,01 mol/L de PBS pendant 30 minutes en agitant quatre fois.
   10. Stocker le cœur dans 0,01 mol/L de PBS/0,02 % d’azoture de sodium à 4 °C.
       REMARQUE : La fixation par perfusion de pression n’est efficace que pour un cœur frais, pas pour un cœur récupéré d’un cadavre embaumé.
2. Dissection macroscopique
   1. Effectuer une dissection progressive à l’aide d’enregistrements photographiques à chaque étape de la dissection.
   2. Pour maintenir la pertinence clinique, faites particulièrement attention à ne pas déformer/déformer les structures afin de maintenir la morphologie physiologique du cœur.
   3. Imagez les structures cibles en utilisant une orientation cliniquement pertinente, telle que l’orientation oblique antérieure droite.
3. Photographie
   1. Placez le cœur perfusé et fixe sur un trépied avec une plate-forme montée avec plusieurs broches et la possibilité de pivoter à 360^°.
   2. Photographiez le cœur à l’aide d’un appareil photo reflex numérique à objectif unique (Figure 5)²⁴ tout en utilisant plusieurs panneaux lumineux à diodes électroluminescentes placés sur les supports en C et un large tissu d’arrière-plan noir duvetyn.
   3. Photographiez à l’aide de l’objectif avec une longue distance focale (200 mm) pour une distance de travail de 4 à 6 pieds afin de minimiser la distorsion du sujet¹⁴.
4. Anaglyphes
   1. Pour afficher des images anaglyphiques, reconstruisez une paire de photographies ou d’images rendues en volume à partir d’ensembles de données CT avec une différence de 10° dans l’angle de rotation sur le plan horizontal.
   2. Convertissez un ensemble de ces images bidimensionnelles (2D), appelé stéréogramme, en anaglyphes à l’aide du logiciel gratuit¹⁶.
   3. Pour afficher un anaglyphe, utilisez des lunettes rouges/cyan.
5. Photogrammétrie
   REMARQUE : La photogrammétrie est la science appliquée qui consiste à générer une reconstruction tridimensionnelle de surface à partir de plusieurs photographies bidimensionnelles prises sous différents angles¹⁷.
   1. Suspendez l’échantillon sur des C-Stands ou placez-le sur la table rotative pour obtenir des centaines de photographies multidirectionnelles avec un smartphone.
   2. Générez le modèle 3D au format FBX à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce.
6. Tomodensitométrie
   REMARQUE : La tomodensitométrie peut être effectuée après la perfusion sous pression et la fixation et à n’importe quel stade de la dissection.
   1. Suspendez l’échantillon de cœur à une barre placée sur le dessus du récipient. Pour éviter que le cœur ne se balance pendant l’examen, soutenez la base du cœur à l’aide de griffes en plastique fixées au fond du récipient. Ainsi, l’air servira de contraste négatif.
   2. Effectuez la tomodensitométrie à l’aide d’un tomodensitomètre multi-détecteurs disponible dans le commerce avec les paramètres suivants : tension du tube de 120 kV, courant du tube de 800-900 mA et rotation du portique de 280 ms. La durée de la dose est généralement de 500 à 1200 mGy.cm.
   3. Reconstruisez les données de l’image axiale à l’aide des paramètres suivants : une épaisseur de section, 0,6 mm ; un intervalle incrémentiel, 0,3 mm ; un champ de vision, le plus petit possible (généralement 100-200 mm) ; et une matrice, 512 × 512.
7. Dissection virtuelle
   1. Analysez les images de tomodensitométrie à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce pour générer des images de dissection virtuelles.
      REMARQUE : La dissection virtuelle est une modification du processus de rendu de volume dans laquelle l’accent est déplacé vers les parois des cavités et des vaisseaux cardiaques¹⁸. Dans ce processus, le seuillage manuel supprime pratiquement la chambre améliorée des ensembles de données d’origine.
   2. Visualisez les parois, les septa et les vannes non améliorées avec une dissection virtuelle pour produire des images similaires à la dissection grossière. Contrairement à la dissection macroscopique des échantillons cardiaques, les plans de coupe lors de la dissection virtuelle sont pratiquement illimités. Presque n’importe quelle vue peut être recréée pour visualiser les structures d’intérêt selon les besoins.
8. Impression 3D
   1. Ouvrez le fichier compatible de l’échantillon de cœur dans le logiciel d’impression 3D.
   2. Utilisez le profil de 0,10 mm Fast DETAIL pour les paramètres d’impression dans l’imprimante 3D et réduisez la vitesse d’impression à 20 mm/s. Activez l’option Générer du matériel de support.
   3. Utilisez le profil du filament TPU pour les « Paramètres du filament » dans l’imprimante 3D.
   4. Utilisez le profil de la buse Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4 pour les « Paramètres de l’imprimante » dans l’imprimante.
   5. Une fois le découpage terminé, enregistrez le fichier BGCODE sur une clé USB pour l’impression 3D.
   6. Utilisez le filament TPU de 1,75 mm pour imprimer en 3D l’échantillon de cœur humain. Avant l’impression 3D, faites sécher le filament TPU pendant 6 h à l’aide d’un séchoir à filament.
   7. Pour réduire la tension du filament lors de l’impression 3D, placez la bobine de filament sur un porte-bobine avec un roulement intégré pour faciliter la rotation de la bobine de filament. Effectuez l’impression 3D à l’aide d’une imprimante 3D disponible dans le commerce avec une tôle d’acier texturée enduite de poudre.
   8. Retirez soigneusement les matériaux de support lorsque l’impression 3D est terminée.

Résultats

Examens à l’échelle microscopique
L’application d’un nettoyage tissulaire permet d’imager de plus grands volumes de tissus en 3D à l’aide de la microscopie confocale. Dans le cœur, les ganglions contenant les neurones cardiaques et la structure neuronale de l’innervation myocardique peuvent être visualisés (Figure 2). La figure 3 montre une image confocale du myocarde du ventricule gauche humain immunomarqué pour les nerfs ...

Discussion

La présente étude démontre le pipeline complet d’analyse d’échantillons obtenus à partir de cœurs humains entiers. Les résultats représentatifs montrent des examens anatomiques à l’échelle microscopique et macroscopique effectués en routine pour un seul cœur. Comme un échantillon de cœur humain est extrêmement précieux, une approche multi-échelle est idéale et efficace afin de ne gaspiller aucune partie de l’échantillon en appliquant plusieurs protocoles à diverses fins, y compris la découver...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P3813
3D Viewer	Microsoft
647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-605-152
647 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED lens	Nikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Antigen Retrieval Buffer (100x EDTA Buffer, pH 8.0)	Abcam	ab93680
Anti-PGP9.5 (protein gene product 9.5)	Abcam	ab108986
Anti-TH (tyrosine hydrox ylase)	Abcam	ab1542
Anti-VAChT (vesicular acetylcholine transporter)	Synaptic Systems	139 103
Benzyl ether	Sigma-Aldrich	108014
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-10G
Cheetah 3D printer filament (95A), 1.75 mm	NinjaTek
Coverslip, 22 mm x 30mm, No. 1.5	VWR	48393 151
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories	711-165-152
Dichloromethane	Sigma-Aldrich	270997-100ML
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8418-500ML
Ethanol, 100%	Decon laboratories	2701
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-500G
GNEXT PET/CT	SOFIE Biosciences
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158-100G
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	H1009-500ML
Imaging software	Zeiss	ZEN (black edition)
Imaging software	Oxford Instruments	Imaris 10
iSpacer	Sunjin Labs	iSpacer 3mm
KIRI Engine	KIRI Innovation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 880
LEAD-2 - Vertical & Multi-channels Peristaltic Pump	LONGER
Lightview XL	Brightech
Methanol (Certified ACS)	Fischer Scientific	A412-4
Nikon D850	Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4	NinjaTek
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-121
Original Prusa MK4 3D printer	Prusa Research
PAP pen	Abcam	ab2601
Paraformaldehyde, 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S
Polycam	Polycam
Primary antibody
PrusaSlicer 2.7.1	Prusa Research
SARA-Engine	pita4 mobile LLC
Scaniverse	Niantic
Secondary antibody
SlowFade Gold Antiface Mountant	Invitrogen	S36936
Sodium azide, 5% (w/v)	Ricca Chemical Company	7144.8-32
SOMATOM Definition AS	Siemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes,	Designs for Vision
Stereomicroscope System SZ61	OLYMPUS
StereoPhoto Maker	Free ware developed by Masuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, Precleaned	Fisher Scientific	12-550-15
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-50ML
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416-100ML
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4L
Ziostation2	Ziosoft, AMIN