Mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA et sa validation

Résumé

Ce protocole est basé sur la mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA. Nous utilisons la cytométrie en flux pour analyser l’annexine V et la double coloration 7-AAD pour détecter la mort cellulaire, en utilisant la cellule entière et en utilisant la microscopie électronique à balayage pour observer la morphologie de la membrane cellulaire.

Résumé

La mort cellulaire est un processus fondamental dans tous les organismes vivants. Le protocole établit un modèle de dépôt lipidique différencié du phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) induit par le lipopolysaccharide (LPS) et l’adénosine triphosphate (ATP) pour observer la mort cellulaire. Le LPS combiné à l’ATP est une méthode d’induction inflammatoire classique, souvent utilisée pour étudier la pyroptose, mais l’apoptose et la nécroptose répondent également à la stimulation par LPS/ATP. Dans des circonstances normales, la phosphatidylsérine n’est localisée que dans le feuillet interne de la membrane plasmique. Cependant, dans les premiers stades de la pyroptose, de l’apoptose et de la nécroptose, la membrane cellulaire reste intacte et exposée à la phosphatidylsérine, et dans les stades ultérieurs, la membrane cellulaire perd son intégrité. Ici, la cytométrie en flux a été utilisée pour analyser la double coloration de l’annexine V et de la 7-aminoactinomycine D (AAD) afin de détecter la mort cellulaire des cellules entières. Les résultats montrent que des cellules substantielles sont mortes après une stimulation avec LPS/ATP. À l’aide de la microscopie électronique à balayage, nous observons les formes possibles de mort cellulaire dans les cellules individuelles. Les résultats indiquent que les cellules peuvent subir une pyroptose, une apoptose ou une nécroptose après stimulation avec LPS/ATP. Ce protocole se concentre sur l’observation de la mort des macrophages après stimulation avec LPS/ATP. Les résultats ont montré que la mort cellulaire après stimulation LPS et ATP n’est pas limitée à la pyroptose et que l’apoptose et l’apoptose nécrotique peuvent également se produire, aidant les chercheurs à mieux comprendre la mort cellulaire après stimulation LPS et ATP et à choisir une meilleure méthode expérimentale.

Introduction

La mort cellulaire est un processus physiologique fondamental chez tous les organismes vivants. Ces dernières années, des études substantielles ont montré que la mort cellulaire est impliquée dans l’immunité et l’équilibre de l’organisme. L’étude de la mort cellulaire nous aide à mieux comprendre l’apparition et le développement des maladies. Plusieurs formes de mort cellulaire programmée ont été décrites, et certaines cibles clés de ces processus ont été identifiées. La pyroptose, l’apoptose et la nécroptose sont les trois voies de mort cellulaire programmées définies génétiquement impliquées dans l’équilibre interne et la maladie¹.

Protocole

1. Lignée cellulaire et culture cellulaire

1. Cultiver la lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 dans un milieu de culture complet RPMI-1640 avec 10 % de sérum fœtal bovin, 1 % de pénicilline-streptomycine et 0,05 mM β-mercaptoéthanol. Cultivez les cellules à 37 °C dans de l’air humidifié à 5% de CO₂ . Sous-culture des cellules tous les 2-3 jours.
   REMARQUE : THP-1 est une cellule de suspension, sélectionnez pour changer la moitié du milieu pour la sous-culture. Lors de l’observation de nombreux fragments cellulaires au microscope optique, centrifuger à 300 x g pendant 3 min à température ambiante. Remettez les cellul....

Discussion

Dans ce manuscrit, deux méthodes ont été utilisées pour détecter la mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA. La double coloration à l’annexine V/7-AAD a été utilisée, et les résultats ont été analysés par cytométrie en flux à partir de la coloration globale. Comme pour les autres analyses cytométriques en flux, un groupe de cellules non colorées et deux groupes de cellules monocolorées ont été mis en place pour exclure les résultats faussement positifs et fau.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1