Mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA et sa validation

Résumé

Ce protocole est basé sur la mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA. Nous utilisons la cytométrie en flux pour analyser l’annexine V et la double coloration 7-AAD pour détecter la mort cellulaire, en utilisant la cellule entière et en utilisant la microscopie électronique à balayage pour observer la morphologie de la membrane cellulaire.

Résumé

La mort cellulaire est un processus fondamental dans tous les organismes vivants. Le protocole établit un modèle de dépôt lipidique différencié du phorbol-12-myristate-13-acétate (PMA) induit par le lipopolysaccharide (LPS) et l’adénosine triphosphate (ATP) pour observer la mort cellulaire. Le LPS combiné à l’ATP est une méthode d’induction inflammatoire classique, souvent utilisée pour étudier la pyroptose, mais l’apoptose et la nécroptose répondent également à la stimulation par LPS/ATP. Dans des circonstances normales, la phosphatidylsérine n’est localisée que dans le feuillet interne de la membrane plasmique. Cependant, dans les premiers stades de la pyroptose, de l’apoptose et de la nécroptose, la membrane cellulaire reste intacte et exposée à la phosphatidylsérine, et dans les stades ultérieurs, la membrane cellulaire perd son intégrité. Ici, la cytométrie en flux a été utilisée pour analyser la double coloration de l’annexine V et de la 7-aminoactinomycine D (AAD) afin de détecter la mort cellulaire des cellules entières. Les résultats montrent que des cellules substantielles sont mortes après une stimulation avec LPS/ATP. À l’aide de la microscopie électronique à balayage, nous observons les formes possibles de mort cellulaire dans les cellules individuelles. Les résultats indiquent que les cellules peuvent subir une pyroptose, une apoptose ou une nécroptose après stimulation avec LPS/ATP. Ce protocole se concentre sur l’observation de la mort des macrophages après stimulation avec LPS/ATP. Les résultats ont montré que la mort cellulaire après stimulation LPS et ATP n’est pas limitée à la pyroptose et que l’apoptose et l’apoptose nécrotique peuvent également se produire, aidant les chercheurs à mieux comprendre la mort cellulaire après stimulation LPS et ATP et à choisir une meilleure méthode expérimentale.

Introduction

La mort cellulaire est un processus physiologique fondamental chez tous les organismes vivants. Ces dernières années, des études substantielles ont montré que la mort cellulaire est impliquée dans l’immunité et l’équilibre de l’organisme. L’étude de la mort cellulaire nous aide à mieux comprendre l’apparition et le développement des maladies. Plusieurs formes de mort cellulaire programmée ont été décrites, et certaines cibles clés de ces processus ont été identifiées. La pyroptose, l’apoptose et la nécroptose sont les trois voies de mort cellulaire programmées définies génétiquement impliquées dans l’équilibre interne et la maladie¹.

La pyroptose se caractérise par la formation de pores membranaires et la libération du contenu cellulaire. Les caspases activées ou granzymes clivent les gasdermines pour séparer leurs domaines N-terminaux, qui s’oligomérisent ensuite, se lient à la membrane et forment des pores ^2,3,4. Le pore de gasdermine fournit un canal de sécrétion atypique à travers les membranes cellulaires, ce qui entraîne des réponses cellulaires en aval, y compris la libération de contenu et l’afflux d’ions ^2,3,4. En fin de compte, les cellules subissent finalement une rupture de la membrane plasmique et une lyse pyroptotique facilitée par la ninjurine-1⁵. Dans l’apoptose, Bax et Bak activés forment des oligomères sur la membrane externe mitochondriale et libèrent le cytochrome C, qui est régulé par un équilibre entre les protéines pro-apoptotiques et anti-apoptotiques de la famille BCL-2, les caspases initiatrices (caspases-8, -9 et -10) et les caspases effectrices (caspases-3, -6 et -7)^1,6,7. Les changements morphologiques de l’apoptose comprennent la coloration membranaire, le rétrécissement cellulaire, la fragmentation nucléaire, la condensation de la chromatine et la formation de corps apoptotiques ^6,8. La sérine/thréonine-protéine kinase 1 (RIPK3) et la kinase de lignée mixte de type domaine (MLKL) sont deux composants centraux en aval du mécanisme nécroptotique¹. RIPK3 recrute et phosphoryle MLKL, p-MLKL oligomérise, s’associe à la membrane cellulaire, initie les perforations membranaires, provoque un afflux d’ions, augmente l’osmolarité intracellulaire et finalement la rupture cellulaire ^6,9. Les gasdermines et MLKL se lient à la membrane plasmique et médient respectivement la pyroptose et la nécroptose, tandis que BAX/BAK médie l’apoptose en se liant à la membrane externe des mitochondries⁶.

Bien que chaque voie ait des mécanismes et des résultats spécifiques, elles entraînent des changements similaires sur la membrane cellulaire. Dans des circonstances normales, la phosphatidylsérine (PS) n’est localisée que dans le feuillet interne de la membrane plasmique. Cependant, dans les premiers stades de la pyroptose, de l’apoptose et de la nécroptose, la PS sera exposée, à l’extérieur de la membrane plasmique. La caspase-3/caspase-7 active les familles TMEM16 et XKR, ce qui conduit à une membrane cellulaire asymétrique et extériorise la PS lors de l’apoptose¹⁰. L’influx de Ca²⁺ médié par la gasdermine D et MLKL entraîne une perte de symétrie de la bicouche phospholipidique sur la membrane cellulaire et l’exposition de PS. L’exposition se produit avant la perte d’intégrité de la membrane cellulaire^11,12. Sur la base des changements similaires dans la membrane de ces trois types de mort cellulaire programmée, nous utilisons la cytométrie en flux pour analyser la double coloration de l’annexine V/7-aminoactinomycine D (7-AAD) afin de détecter la mort cellulaire. L’annexine V, une protéine de liaison aux phospholipides dépendante du calcium, a une grande affinité pour le PS, qui peut servir de sonde sensible pour détecter le PS exposé à la surface de la membrane plasmique¹³. Le 7-AAD est une coloration d’acide nucléique qui ne peut pas traverser toute la membrane cellulaire. Il est similaire à l’iodure de propidium (PI), un colorant d’acide nucléique couramment utilisé. Ils ont des caractéristiques de fluorescence similaires, mais le 7-AAD a un spectre d’émission plus étroit et moins d’interférences avec d’autres canaux de détection. En raison de ces similitudes, il ne suffit pas de faire la distinction entre la pyroptose, l’apoptose et la nécroptose. Nous avons utilisé la cytométrie en flux pour détecter la mort cellulaire à partir de cellules entières. Une deuxième méthode est utilisée pour capturer la membrane cellulaire à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB) afin d’observer les formes possibles de mort cellulaire dans les cellules individuelles.

Nous avons établi un modèle de dépôt lipidique différencié du dépôt lipidique différencié dans le monocyte humain (THP-1) induit par le lipopolysaccharide (LPS) et l’adénosine triphosphate (ATP) pour observer la mort cellulaire. Ce protocole se concentre sur l’observation de la mort cellulaire plutôt que sur l’étude des mécanismes.

Protocole

1. Lignée cellulaire et culture cellulaire

1. Cultiver la lignée cellulaire monocytaire humaine THP-1 dans un milieu de culture complet RPMI-1640 avec 10 % de sérum fœtal bovin, 1 % de pénicilline-streptomycine et 0,05 mM β-mercaptoéthanol. Cultivez les cellules à 37 °C dans de l’air humidifié à 5% de CO₂ . Sous-culture des cellules tous les 2-3 jours.
   REMARQUE : THP-1 est une cellule de suspension, sélectionnez pour changer la moitié du milieu pour la sous-culture. Lors de l’observation de nombreux fragments cellulaires au microscope optique, centrifuger à 300 x g pendant 3 min à température ambiante. Remettez les cellules en suspension dans le milieu de culture cellulaire complet frais préchauffé.
2. Utilisez des cellules (dans les passages 4 à 10) à la phase de croissance logarithmique pour toutes les expériences. Lorsque les cellules sont en bon état et en phase de croissance logarithmique, elles sont rondes, brillantes, denses et sans amas ni fragments cellulaires sous le microscope optique à 100 x.

2. Différenciation des cellules THP-1

1. Préparez une solution mère de PMA avec une concentration de 1 mM (dissoudre 1 mg de PMA dans 1,62 mL de diméthylsulfoxyde). Diluer la solution mère de PMA avec un milieu de culture cellulaire complet jusqu’à une concentration de travail finale de 100 nM.
2. Recueillir les cellules dans la boîte de culture dans un tube à centrifuger stérile de 10 ml. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à température ambiante, remettre en suspension les cellules avec 3 mL de milieu de culture complet contenant du PMA.
3. Ouvrez le compteur de cellules et le logiciel de comptage. Pipetez 20 μL de suspension cellulaire sur le panneau de compteur de cellules et insérez-le dans le panneau de compteur de cellules. Cliquez sur Aperçu B1, tournez le bouton en bas à droite de l’instrument et ajustez la distance focale pour que les cellules aient un centre lumineux avec des contours clairs sur le logiciel. Cliquez sur Compter pour commencer à compter.
4. D’après les résultats du comptage, utiliser un milieu de culture complet contenant du PMA pour ajuster la densité cellulaire à 1 x 10⁶ cellules/mL. Dans une plaque à 6 puits, incubez la plaque pendant 24 h à 37 °C et 5 % de CO₂ avant de commencer le traitement.

3. Traitement des cellules THP-1

1. Préparez une solution mère de LPS avec une concentration de 1 mg/mL (dissoudre 1 mg de LPS dans 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS)). Diluer la solution mère de LPS avec un milieu sans sérum jusqu’à une concentration de travail finale de 1 μg/mL. Préparez une solution mère de Na₂ATP à une concentration de 500 mM (dissoudre 0,3026 g d’ATP dans 1 mL de PBS).
2. Aspirez le milieu contenant du PMA des puits et lavez-le avec du PBS 1x. Ajouter le milieu sans sérum au groupe témoin et le milieu sans sérum contenant du LPS au groupe modèle. Incuber la plaque pendant 6 h à 37 °C + 5% de CO₂ avant de poursuivre le traitement.
3. Après 6 h, ajouter la solution mère d’ATP au groupe modèle jusqu’à une concentration de travail finale de 500 nM. Incuber la plaque pendant 45 min à 37 °C + 5% de CO₂ avant de continuer.

4. Analyse par cytométrie en flux (Méthode 1)

1. Préparation d’échantillons expérimentaux
   1. Ensemencez et incubez les cellules dans des plaques à 6 puits selon l’étape 2. Établissez quatre groupes de témoins sans traitement : un témoin sans colorant, deux témoins monocolores (un pour chaque colorant) et un témoin témoin double colorant. Établissez un groupe de traitement et traitez selon l’étape 3.
   2. Après le traitement, aspirez tout le surnageant des puits et lavez-le avec du PBS 2x. Ajouter 500 μL de trypsine à 0,05 % (non EDTA) dans chaque puits et incuber dans l’incubateur pendant 30 s.
   3. Ajouter 1 mL de milieu de culture complet RPMI-1640 dans chaque puits pour empêcher le détachement des cellules et recueillir les cellules dans le tube de 5 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à température ambiante.
   4. Ajouter 1 mL de PBS pour remettre les cellules en suspension. Placez les tubes avec les cellules dans un bain-marie à 37 °C pendant 3 min. Centrifuger tous les échantillons à 300 x g pendant 3 min à température ambiante.
   5. Diluer 200 μL de 5x tampon de liaison avec 800 μL d’eau distillée dans 1x tampon de liaison. Ajoutez 100 μL de 1x tampon de liaison pour remettre les cellules en suspension et transférez les cellules dans le tube de 5 mL.
   6. Ajouter 5 μL de solution d’Annexin V-PE dans un tube de cellules du groupe témoin pendant 10 min et 5 μL de solution 7-AAD dans un autre tube de cellules du groupe témoin pendant 5 min (en tant que témoins de coloration unique séparément). Agitez doucement chaque tube pour mélanger le colorant et incuber les échantillons à température ambiante à l’abri de la lumière. Ajouter 400 μL de PBS dans chaque tube et agiter doucement pour terminer l’incubation.
   7. Ajouter 5 μL de solution d’Annexin V-PE dans les tubes restants et incuber pendant 5 min à température ambiante. Agitez doucement chaque tube pour mélanger le colorant et incuber les échantillons à température ambiante à l’abri de la lumière. Après 5 min, ajouter 5 μL de solution de 7-AAD pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 400 μL de PBS dans chaque tube et agiter doucement pour terminer l’incubation.
   8. Filtrez la suspension cellulaire à l’aide d’un treillis en nylon de 35 μm qui fait partie des tubes à fond rond en polystyrène de 5 ml. Placez le tube sur de la glace et attendez le test. Mélangez doucement avant de tester, puis insérez-le dans l’instrument.
2. Cytométrie en flux
   1. Utilisez un cytomètre de flux de tri cellulaire activé par fluorescence pour les tests. Ouvrez le logiciel d’analyse des données du cytomètre en flux et confirmez les performances du détecteur et du laser. Cliquez sur le cytomètre et choisissez Fluidics start, attendez que le système soit prêt. Excluez les bulles de la chambre d’écoulement en cliquant sur Cytomètre > Modes de nettoyage > Cellule d’écoulement de dégaz.
   2. Cliquez sur Expérience, sélectionnez successivement Nouveau dossier, Expérience, Échantillon, Tube et Modifier le nom. Une flèche de forme pentagonale à l’avant du tube devient verte lorsqu’elle est allumée.
   3. Cliquez sur l’icône du cytomètre FACSCelesta (icône de touche de raccourci), sélectionnez Paramètre, puis sélectionnez Signal FSC, SSC et PE . Cliquez sur l’icône de la feuille de calcul globale (icône de touche de raccourci) pour établir l’histogramme PE. Pour le cytomètre en flux utilisé dans cette étude, utiliser l’EP pour l’annexine V à 586 nm et tracer sur l’axe des abscisses ; PerCP-Cy5.5 pour 7-AAD à 700 nm et tracé sur l’axe Y.
   4. Insérez d’abord l’échantillon de contrôle non coloré dans l’instrument. Cliquez sur l’icône du tableau de bord d’acquisition (une icône de raccourci), acquérez un minimum de 10 000 événements de la population souhaitée. Exclure les débris à l’aide d’une porte (P1) sur un diagramme à points FSC-A et SSC-A. Ajustez le débit à la vitesse moyenne et enregistrez les données. Ajustez la tension pour placer la population de cellules sur la diagonale de l’histogramme FSC/SSC et cliquez sur Redémarrer. Ajustez le débit à la vitesse moyenne et enregistrez les données.
   5. Cliquez sur Tube suivant, exécutez les commandes de coloration unique d’Annexin V et de 7-AAD pour ajuster la compensation. Faites fonctionner les tubes restants et collectez des données.

5. Imagerie MEB (Méthode 2)

1. Préparation d’échantillons expérimentaux
   1. Ensemencez et incubez les cellules dans des plaques à 6 puits selon l’étape 2 et traitez selon l’étape 3.
   2. Après le traitement, aspirez tout le surnageant des puits et lavez-vous 2 fois avec du PBS. Ajouter 500 μL de trypsine à 0,05 % (non EDTA) dans chaque puits et incuber dans l’incubateur pendant 30 s.
   3. Ajouter 1 mL de milieu de culture complet RPMI-1640 dans chaque puits pour empêcher le détachement des cellules et recueillir les cellules dans le tube de 5 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à température ambiante.
   4. Fixer les cellules avec 500 μL de fixateur de microscope électronique (2,5 % de dialdéhyde d’acide glutarique, 100 mM de sels de phosphore) pendant 2 h à température ambiante, puis une nuit à 4 °C.
   5. Préparez une solution d’alun de chrome : Ajoutez 1,0 g de gélatine à 100 ml d’eau ultrapure, à 70 °C de chauffage au bain-marie et remuez uniformément. Ajouter 0,05 g d’alun de chrome, mélanger uniformément et filtrer avec du papier filtre. Trempez le verre de couverture propre dans une solution d’alun de chrome pendant 2 h à 37 °C et séchez-le dans un four à 37 °C pour une utilisation ultérieure.
      REMARQUE : Le but est d’empêcher le détachement des cellules pendant l’expérience.
   6. Prélever les cellules à partir d’une solution fixe. Centrifuger à 300 x g pendant 3 min à température ambiante. Ajoutez 100 μL de PBS et soufflez doucement les cellules. Déposez la suspension de la cellule sur la vitre de protection, laissez reposer pendant 5 min. Aspirez tout le surnageant et lavez 3 fois avec du PBS pendant 5 minutes à chaque fois.
      REMARQUE : L’opération doit être effectuée en douceur pour éviter le détachement des cellules. Ne secouez pas vigoureusement, déplacez-vous lentement et ajoutez lentement du liquide le long de la paroi.
   7. Ajouter 500 μL de fixation d’acide osmique à 1 % pendant 1 heure. Aspirez tout le surnageant et lavez 3 fois avec du PBS pendant 5 minutes à chaque fois.
   8. Déshydrater successivement les échantillons dans une série de concentrations d’éthanol (EtOH) (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%) pendant 15 min par solution d’EtOH.
      REMARQUE : Les verres de protection peuvent être conservés à 100% EtOH pendant plusieurs jours à 4 °C mais ils doivent sécher dès que possible pour éviter une déshydratation excessive.
   9. Allumez le sécheur à point critique, ouvrez le réservoir de CO₂ , refroidissez la chambre à 10 °C. Enveloppez rapidement l’échantillon avec du papier filtre lorsque la pression de la chambre est de 0 psi et placez-le dans la chambre.
   10. Ouvrez la vanne d’entrée, observez à travers la fenêtre d’observation du CO₂ , augmentez le niveau de CO₂ liquide entre les deux lignes rouges (ne dépassez pas la limite supérieure), fermez la vanne d’entrée. Faites tremper l’échantillon pendant 10 min. Ouvrez simultanément les soupapes d’entrée et d’échappement pour égaliser le CO₂ pendant 1 min (le CO₂ liquide déplace l’EtOH). Fermez la soupape d’échappement pour élever le niveau de CO₂ liquide à la position spécifiée, fermez la soupape d’admission.
   11. Réglez la température à 35 °C et la pression à 1250 psi. Une fois que la température et la pression se stabilisent, dépressuriser à 100 psi/min. Retirez l’échantillon lorsque la pression de la chambre est nulle et éteignez l’instrument.
   12. Montez les échantillons sur des supports d’échantillons en aluminium MEB à l’aide d’un ruban conducteur. Utilisez une coucheuse par pulvérisation cathodique pour recouvrir les échantillons d’une couche (2-5 nm) d’or.
2. Imagerie
   1. Utilisez le MEB à émission de champ froid à haute résolution pour l’imagerie. Réglez la tension d’accélération du MEB à 3 kV. Réglez la distance de travail à 10 mm. Réglez le grossissement sur 1 000x pour observer le panorama. Réglez le grossissement sur 5 000x et 20 000x pour localiser la membrane plasmique et imager l’échantillon.
      REMARQUE : Le processus de visualisation des macrophages THP-1 différenciés par PMA via le MEB est similaire à celui d’autres types de cellules et de tissus et dépend des instruments utilisés. La référence¹⁴ fournit un protocole SEM détaillé avec des vidéos d’accompagnement.

Résultats

Les échantillons de cellules ont été traités comme décrit dans le protocole et la détection par cytométrie en flux a été effectuée. Les cellules normales ne peuvent pas être colorées avec de l’Annexine V et du 7-AAD (Annexine V-/7-AAD-). Dans les premiers stades de la pyroptose, de l’apoptose et de la nécroptose, la PS a été exposée et liée à l’annexine V, mais la membrane cellulaire était encore intacte et excluait le 7-AAD de l’espace extracellulaire (Annexine V+/7-AAD-). Dans les stades ult?...

Discussion

Dans ce manuscrit, deux méthodes ont été utilisées pour détecter la mort induite par le LPS et l’ATP des macrophages THP-1 différenciés par PMA. La double coloration à l’annexine V/7-AAD a été utilisée, et les résultats ont été analysés par cytométrie en flux à partir de la coloration globale. Comme pour les autres analyses cytométriques en flux, un groupe de cellules non colorées et deux groupes de cellules monocolorées ont été mis en place pour exclure les résultats faussement positifs et fau...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% pancreatic enzyme solution (excluding EDTA)	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0068
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube	CORNING	352235
5 mL centrifuge tube	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-50-M
6-well plate	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis analysis kit	Absin (Shanghai) Biological Technology co.ltd	abs50007	Annexin V-PE, 7-AAD, 5×Binding buffer, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 incubator	Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.	N/A
cell culture dish, 100 mm	Sorfa Life Science Research Co.,Ltd	230301
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter	Nexcelom Bioscience LLC	Cellometer K2
Cellometer SD100 Counting Chambers	Nexcelom Bioscience LLC	CHT4-SD100-002
centrifuge machine	Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd	L530
chromium alum	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA04354
cover glasses, 9 mm	Labgic Technology Co., Ltd.	BS-09-RC
critical point dryer	Quorum Technologies	K850
dimethyl sulfoxide	BOSTER Biological Technology co.ltd	PYG0040
electron microscope fixative	Servicebio Technology co.ltd	G1102	2.5% glutaric dialdehyde, 100 mM phosphorous salts
electronic balance	SHIMADZU	ATX124
ethanol absolute	Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd	2021033102
flow cytometer	Becton,Dickinson and Company	FACSCanto
flow cytometry analysis software	Becton,Dickinson and Company	BD FACSDivaTM Software
gelatin	Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.	PA00256
High resolution cold field emission scanning electron microscope	TITACHI	Regulus 8100
human monocytic cell line THP-1	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CL0233
inverted microscope	Leica Microsystems Co., Ltd	DMi1
IR Vortex Mixer	VELP Scientifica Srl	ZX4
lipopolysaccharide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	L8880	LPS is derived from Escherichia coli 055:B5
Na2ATP	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	P6741
phosphate-buffered saline	Servicebio Technology co.ltd	G4202
Pipette	Eppendorf AG	N/A
pipette tips, 10 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-10PL
pipette tips, 1 mL	Servicebio Technology co.ltd	T-1250L
pipette tips, 200 μL	Servicebio Technology co.ltd	T-200L
RPMI-1640 complete culture media	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.	CM0233	RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM β-mercaptoethanol + 1% P/S
RPMI-1640 culture media	Shanghai BasalMedia Technologies Co., LTD.	K211104
sheath fluid	BECKMAN COULTER	8546733
sputter coater	Cressington Scientific Instruments Ltd	108
thermostatic water bath	GUOHUA Electric Appliance CO.,Ltd	HH-1