Préparation d’îlots fœtaux de primates non humains congelés pour le séquençage combiné de l’ARN à noyau unique et du séquençage ATAC, et la métabolomique en vrac

Résumé

Ce protocole décrit les procédures d’isolement de noyaux de haute qualité à partir d’îlots pancréatiques de primates non humains congelés pour une utilisation dans le séquençage simultané de l’ARN et le séquençage ATAC d’un seul noyau, tout en préservant la fraction cytosolique en vrac pour les analyses métabolomiques à partir des mêmes échantillons.

Résumé

L’un des défis des études utilisant des tissus prélevés dans plusieurs cohortes est d’éviter les effets de lot lors de la préparation d’expériences multi-omiques à grande échelle, telles que le séquençage combiné de l’ARN unicellulaire et la métabolomique. La méthode de la présente étude utilise des îlots pancréatiques congelés de primates fœtaux non humains prélevés sur une période de deux ans pour être utilisés dans les tests de séquençage de l’ARN à noyau unique et de séquençage ATAC. La fraction cytosolique générée lors de l’extraction nucléaire a été retenue pour l’électrophorèse capillaire en aval-spectrométrie de masse et la quantification ultérieure des métabolites. Cette méthode permet d’analyser en vrac les métabolites qui contribuent à l’évolution des paysages transcriptomiques et épigénomiques dans des conditions expérimentales. Il s’applique à de nombreux types de tissus et maximise la quantité d’informations qui peuvent être extraites d’échantillons qui ne sont pas facilement disponibles. À mesure que la contribution du métabolisme à l’établissement de l’identité cellulaire via les modifications épigénétiques devient plus appréciée, les techniques permettant d’identifier la contribution des métabolites dans des types cellulaires spécifiques sont opportunes et nécessaires.

Introduction

Les îlots pancréatiques de Langerhans sont essentiels à la gestion de la tolérance au glucose tout au long de la vie. L’incapacité à régler correctement la glycémie via l’hormone hypoglycémiante, l’insuline, ou l’hormone augmentant le glucose, le glucagon, entraîne un diabète sucré¹. Les facteurs de risque modifiables pour minimiser le risque de diabète comprennent l’exercice et l’alimentation. De plus, il devient clair que l’alimentation maternelle pendant la grossesse a également un effet sur la susceptibilité de la progéniture au diabète à l’âge adulte ^2,3

Protocole

La récupération des îlots a été effectuée conformément aux directives de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Centre national de recherche sur les primates de l’Oregon (ONPRC) et de l’Oregon Health and Science University, et a été approuvée par l’ONPRC IACUC. L’ONPRC se conforme à la loi sur le bien-être animal et aux règlements appliqués par le ministère de l’Agriculture des États-Unis (USDA) et à la politique du service de santé publique sur les soins sans cruauté et l’utilisation des laboratoires. Le présent protocole a été appliqué aux îlots de macaques rhésus fœtaux qui ont été autopsiés au 145e jour de gestat....

Discussion

Historiquement, les méthodes d’isolement nucléaire pour le séquençage de l’ARN et de l’ATAC à noyau unique ont utilisé des tampons contenant des détergents incompatibles avec la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS), une technique couramment utilisée pour la quantification des métabolites^16,17. Le protocole actuel permet de combiner des techniques transcriptomiques et méta.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
33 G rat brain cannula injector	Protech International	8IC315IS5SPC	For duct cannulation and pancreas inflation
Penicillin/Streptomycin	Fisher	15-140-122	For RT media
FBS	Millipore/Sigma	F4135-500ML	For RT media
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	11-875-135	For RT media
Collagenase P	Sigma Aldrich	11213865001	For digestion of pancreas
Bovine Dnase I	Sigma Aldrich	11284932001	For RT media and isolation
Dextrose	Fisher	D16-1	Final concentration will be 2.8 mM
Calcium Chloride	Fisher	C4901-500G	Final concentration will be 0.5 mM
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration will be 10 mM
Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction 5	Research Products International	A30075100	Final concentration will be 0.5 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	11966025	For handpicking islets
20x Nuclei Buffer	10X Genomics	2000153/2000207
Digitonin (5%)	Thermo Fisher Scientific	BN2006	Digitonin may need to be warmed to 65 °C to dissolve white precipitate
MACS SmartStrainers (30 µM)	Miltenyi Biotec	130-098-458
MACS BSA Stock Solution (10%)	Miltenyi Biotec	130-091-376
IGEPAL CA-630	Sigma Aldrich	i8896	Prepare a 10% stock using MilliQ water
Trizma Hydrochloride Solution, pH 7.5	Sigma Aldrich	T2319-1L
Sodium Chloride Solution, 5 M	Sigma Aldrich	S6546-1L
Magnesium Chloride Solution, 1 M	Sigma Aldrich	M1028-100mL
Sigma Protector Rnase inhibitor	Sigma Aldrich	3335402001
DTT	Research Products International	D11000-5.0
Rnase-Free Disposable Pellet Pestles	Fisher Scientific	12-141-368
Tween 20	Fisher Bioreagents	BP337-500	Prepare a 20% stock using MilliQ water
Nuclease-Free Water	Promega	PR-P1193
DNA LoBind Tubes (5 mL)	Eppendorf	30108310
Cryovials (1.5 mL)	VWR	20170-225
Posi-Click Tubes (0.6 mL)	Denville	C-2177
Trypan Blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T-10282
Dual-Chamber Cell Counting Slides	Bio-Rad	1450011
MiiliQ Ultrapure Water System	Millipore/Sigma	7003/05/10/15
5 kDa cut-off filter	HMT Metabolome Technologies
Internal Standards	HMT Metabolome Technologies
P10, P20, P200, and P1000 Pipettes	Eppendorf	2231000602
Pipette Tips, 10 µL	VWR	76322-528
Pipette Tips, 1000 µL	Thermo Fisher Scientific	21-236-2A
Pipette Tips, 20 µL	Genesee Scientific	23-404
Pipette Tips, 200 µL	USA Scientific	1120-8810
Phase Contrast Microscope	Olympus	BX41-PH-B
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
DPBS (1x)	Gibco	14190-144
Allegra X-30R Centrifuge	Beckman-Coulter	B06315
RNase-ZAP	Sigma Aldrich	R2020