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Transformation mitochondriale chez Baker
Dans cet article
Résumé
Ce travail explique comment transformer les mitochondries de levure à l’aide d’une méthode biolistique. Nous montrons également comment sélectionner et purifier les transformants et comment introduire la mutation souhaitée dans la position cible dans le génome mitochondrial.
Résumé
La levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae est largement utilisée pour comprendre la biologie mitochondriale depuis des décennies. Ce modèle a fourni des connaissances sur les voies mitochondriales essentielles et conservées chez les eucaryotes et les voies spécifiques aux champignons ou aux levures. L’une des nombreuses capacités de S. cerevisiae est la capacité de manipuler le génome mitochondrial, ce qui n’est jusqu’à présent possible que chez S. cerevisiae et l’algue unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii. La transformation biolistique des mitochondries de levure nous permet d’introduire des mutations dirigées vers le site, de faire des réarrangements génétiques et d’introduire des rapporteurs. Ces approches sont principalement utilisées pour comprendre les mécanismes de deux processus hautement coordonnés dans les mitochondries : la traduction par les mitoribosomes et l’assemblage de complexes respiratoires et d’ATP synthase. Cependant, la transformation mitochondriale peut potentiellement être utilisée pour étudier d’autres voies. Dans le présent travail, nous montrons comment transformer les mitochondries de levure par bombardement de microprojectiles à grande vitesse, sélectionner et purifier le transformant prévu, et introduire la mutation souhaitée dans le génome mitochondrial.
Introduction
La levure Saccharomyces cerevisiae est un modèle largement reconnu utilisé pour étudier la biogenèse mitochondriale. Comme la levure est un organisme anaérobie et facultatif, il est possible d’étudier de manière approfondie les causes et les conséquences de l’introduction de mutations qui altèrent la respiration. De plus, cet organisme possède des outils génétiques et biochimiques amicaux pour étudier les voies mitochondriales. Cependant, l’une des ressources les plus puissantes pour explorer les mécanismes de l’assemblage des complexes respiratoires et de la synthèse des protéines mitochondriales est la capacité de transformer les mitochondries et de modifie....
Protocole
REMARQUE : Nous recommandons d’effectuer six transformations pour chaque construction, car l’efficacité de la transformation mitochondriale est généralement faible. La composition des différents milieux de croissance est indiquée au tableau 2.
1. Préparation des particules de tungstène
- Peser 30 mg de particules de tungstène de 0,7 μm (WP, microsupports) dans un microtube. Ajouter 1,5 mL d’éthanol à 70 % (EtOH) pour stériliser. Vortex les WP et laissez-les reposer 10 min à température ambiante.
- Centrifugeuse à 13 200 x g pendant 15 min à température ambiante. Lavez les WP en ajou....
Résultats Représentatifs
Cette section présente quelques résultats représentatifs des différentes étapes de la transformation mitochondriale. La figure 6 montre une procédure de bombardement. Les rhocellules synthétiques portaient un plasmide bactérien avec le gène rapporteur ARG8m, qui remplacera la séquence codante d’un gène mitochondrial (Figure 6A). Après le bombardement, la plaque a été répliquée sur un milieu dépourvu d’uracile (.......
Discussion
Le présent travail a décrit comment transformer avec succès les mitochondries de la levure S. cerevisiae . Le processus, depuis le bombardement de microprojectiles à grande vitesse jusqu’à la purification de la souche de levure prévue, prend ~8 à 12 semaines, selon le nombre de cycles de purification de la souche synthétique rho-soutin nécessaires. Certaines des étapes critiques de la méthode sont les suivantes. Tout d’abord, plus les régions flanquantes ajoutées autour du site de mut.......
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Cette publication a bénéficié du soutien du Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), de l’UNAM [IN223623 à XP-M]. L’UPD est un boursier CONAHCYT (CVU :883299). Nous tenons à remercier le Dr Ariann Mendoza-Martínez pour son aide technique avec les images au microscope optique. Licences Biorender : DU26OMVLUU (Figure 2) ; BK26TH9GXH (figure 3) ; GD26TH80R5 (figure 4) ; PU26THARYD (figure 7) ; ML26THAIFG (figure 9).
....matériels
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL pipette tips | Axygen | T-1000-B | |
| 1.5 mL Microtube | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 μL pipette tips | Axygen | T-10-C | |
| 15 mL conical bottom tube | Axygen | SCT-25ML-25-S | |
| 200 μL pipette tips | Axygen | T-200-Y | |
| 50 mL conical bottom tube | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| AfiII | New England BioLabs | R0520S | |
| Agarose | SeaKem | 50004 | |
| Analytic balance | OHAUS | ARA520 | |
| Autoclave | TOMY | ES-315 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Biolisitic Macrocarrier holder | BIO-RAD | 1652322 | |
| Bunsen burner | VWR | 89038-528 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CSM -ADE | Formedium | DCS0049 | |
| CSM -ARG | Formedium | DCS0059 | |
| CSM -LEU | Formedium | DCS0099 | |
| CSM -URA | Formedium | DCS0169 | |
| Culture glass flask | KIMAX KIMBLE | 25615 | |
| Culture glass tube | Pyrex | 9820 | |
| Dextrose | BD | 215520 | |
| Ethanol | JT Baker | 9000 | |
| Forceps | Millipore | 620006 | |
| Glass beads | Sigma | Z265926 | |
| Glass handle | Sigma | S4647 | |
| Glycerol | JT BAKER | 2136-01 | |
| Helium tank grade 5 (99.99 %) | - | - | |
| HSTaq Kit | PCR BIO | ||
| Microcentrifugue | Eppendorf | 022620100 | |
| NdeI | New England BioLabs | R0111L | |
| Orbital shaker | New Brunswick scientific | NB-G25 | |
| PCR tubes | Axygen | PCR-02-C | |
| PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System | BIO-RAD | 165-2257 | |
| Petri dishes (100X10) | BD | 252777 | |
| QIAprep Spin Miniprep | Qiagen | 27106 | |
| Raffinose | Formedium | RAF03 | |
| Replica plater | Scienceware | Z363391 | |
| Rupture discs 1350 Psi | BIO-RAD | 1652330 | |
| Sorbitol | Sigma | S7547 | |
| Spermidine | Sigma | S0266 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Scientific | EL0011 | |
| Tissue Culture Rotator | Thermo Scientific | 88882015 | |
| Tungsten microcarriers M10 | BIO-RAD | 1652266 | |
| Vaccum pump of 100L/min capacity | - | - | |
| Velvet pads | Bel-Art | H37848-0002 | |
| Vortex | Scientifc Industries | SI-0236 | |
| Wood aplicator stick | PROMA | 1820060 | |
| Yeast extract | BD | 212750 | |
| Yeast Nitrogen base without aminoacids | BD | 291920 |
Références
- Bonnefoy, N., Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).
- Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. <....
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