Préparation de microsphères d’alginate de sodium réticulées avec différents ions métalliques à l’aide de la technologie d’électronébulisation microfluidique

Résumé

Le protocole décrit la préparation de microsphères d’alginate de sodium réticulées avec différents ions métalliques à l’aide d’un dispositif microfluidique pour la conception de supports de médicaments. Les propriétés antimicrobiennes et la libération lente de ces microsphères ont également été étudiées.

Résumé

Les microsphères sont des particules de taille micrométrique qui peuvent charger et libérer progressivement des médicaments par encapsulation physique ou adsorption sur la surface et dans les polymères. Dans le domaine de la biomédecine, les microsphères d’hydrogel ont été largement étudiées pour leur application en tant que vecteurs de médicaments en raison de leur capacité à réduire la fréquence d’administration des médicaments, à minimiser les effets secondaires et à améliorer l’observance du patient. L’alginate de sodium (ALG) est un polysaccharide linéaire naturel avec trois liaisons glycosidiques de squelette. Il y a deux groupes hydroxyles auxiliaires présents dans chacune des fractions du polymère, qui ont les caractéristiques d’une fraction hydroxyle d’alcool. Les unités ALG synthétiques peuvent subir des réactions chimiques de réticulation avec des ions métalliques, formant une structure de réseau réticulé d’empilements de polymères, formant finalement un hydrogel. Les microsphères d’hydrogel peuvent être préparées à l’aide d’un processus simple impliquant les propriétés de réticulation ionique de l’ALG. Dans cette étude, nous avons préparé des microsphères d’hydrogel à base d’ALG (ALGMS) en utilisant une stratégie d’électrodéposition microfluidique. Les microsphères d’hydrogel préparées étaient de taille uniforme et bien dispersées, grâce au contrôle précis du flux d’électronébulisation microfluidique. Des ALGMS réticulés avec différents ions métalliques ont été préparés à l’aide d’une technique d’électropulvérisation microfluidique combinant microfluidique et champ électrique élevé, et ses propriétés antimicrobiennes, sa capacité de libération lente de médicaments et sa biocompatibilité ont été étudiées. Cette technologie est prometteuse pour le développement et la production de médicaments avancés.

Introduction

Les systèmes d’administration de médicaments sont un haut lieu de la recherche dans le domaine de l’ingénierie biotissulaire, visant à améliorer l’efficacité de l’administration de médicaments et à réduire les effets indésirables et les effets secondaires¹. Parmi ces systèmes, les microsphères d’hydrogel, caractérisées par une bonne biocompatibilité, des propriétés mécaniques réglables et une plasticité fonctionnelle, sont l’un des véhicules les plus couramment utilisés pour le chargement et l’administration de médicaments². Ils peuvent être utilisés pour la libération lente et contrôlée de médicaments, fournir de bons effets protecteurs pour les médicaments, éviter ou minimiser les effets non spécifiques des médicaments dans d’autres tissus et cibler l’administration de médicaments à des structures tissulaires spécifiques³. Par conséquent, les microsphères d’hydrogel sont devenues un nouveau système d’administration de médicaments efficace, avec l’émergence progressive de la recherche dans ce domaine⁴.

Les microsphères d’hydrogel sont généralement synthétisées à partir de matériaux biodégradables, notamment des polysaccharides, des protéines et des polymères naturels⁵. Parmi eux, l’ALG est un polysaccharide biocompatible et biodégradable extrait d’algues brunes marines⁶. Sa chaîne moléculaire contient des groupes hydroxyles et carboxyles libres qui peuvent se réticuler avec la plupart des cations divalents ou multivalents pour former une structure d’hydrogel insoluble dans l’eau avec un réseau tridimensionnel⁵. Les microsphères d’hydrogel formées par l’ALG peuvent être converties en polyélectrolytes chargés négativement dans des solutions neutres et alcalines. Cette répulsion entre les charges négatives fait gonfler les microsphères, ce qui permet la libération de l’ingrédient actif encapsulé ou du médicament. Ces propriétés ont conduit à considérer les microsphères ALG comme des vecteurs de médicaments prometteurs largement utilisés pour le chargement et la libération contrôlée^{de médicaments 7}.

Différentes méthodes existent pour la préparation des microsphères d’hydrogel. Les méthodes traditionnelles de préparation de l’ALGMS comprennent généralement la méthode sol-gel ou la méthode émulsion-sol. Ces méthodes impliquent des étapes telles que la précipitation, la co-précipitation et les réactions de gélification pour obtenir les microsphères cibles⁸. Au cours des dernières années, avec le développement continu de la technologie microfluidique, la méthode d’électropulvérisation microfluidique est progressivement devenue une méthode de préparation de microsphères efficace et précise⁹. Cette méthode utilise la technologie microfluidique pour électropulvériser une solution polymère à travers une buse microfine afin de former des gouttelettes et des microsphères de taille micrométrique au cours du processus de durcissement ou de réticulation^{ultérieur 10}. Par rapport à la méthode traditionnelle, l’électronébulisation microfluidique offre un contrôle précis de la taille et de la morphologie des particules de microsphères en ajustant des paramètres tels que le débit de la solution, la tension et la taille de la buse fine¹¹. Il permet également une préparation continue à grande vitesse des microsphères, améliorant ainsi l’efficacité de la préparation et maintenant des conditions de réaction douces. De plus, les ALGMS peuvent être préparés pour posséder diverses fonctions, telles que des médicaments à libération contrôlée et des catalyseurs chargés, ce qui permet leur application facile dans divers domaines.

Nous présentons ici un protocole pour la préparation des microsphères ALG à l’aide de la méthode d’électronébulisation microfluidique. Le processus consiste à faire passer une solution d’ALG à travers un dispositif microfluidique et à la soumettre à une électropulvérisation. Les gouttelettes résultantes ont été collectées dans la solution contenant différents ions métalliques (Ca²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ et Fe³⁺) pour initier la réaction de réticulation. Cette réaction améliore la stabilité et l’adhérence des microsphères et les dote de différentes fonctionnalités. Cette méthode est facile à mettre en œuvre, et les microsphères synthétisées présentent une bonne uniformité de taille dans leur morphologie. De plus, nous avons étudié leurs propriétés antimicrobiennes, leur capacité de libération lente des médicaments et leur biocompatibilité. Ce protocole sera utile pour la poursuite du développement et de la production de médicaments.

Protocole

Le sang utilisé dans les expériences a été obtenu à partir de souris femelles BALB/c de grade SPF pesant 20 à 25 g et âgées d’environ 7 semaines. Le comité d’éthique de l’expérimentation animale du Zhejiang Shuren College a approuvé tous les soins aux animaux et les procédures expérimentales.

1. Préparation de la solution

1. Peser l’ALG et le dissoudre dans de l’eau ultra-pure en agitant au bain-marie à 50 °C pour obtenir une solution d’ALG à 2 %.
2. Préparez séparément la fraction massique avec des solutions à 5 % (ou la concentration massique molaire est de 0,3 M) de CaCl₂, FeCl₃, ZnSO₄ et CuSO₄ dans de l’eau ultrapure. Versez chaque solution séparément dans un plat de collecte.

2. Dispositif d’électropulvérisation microfluidique

1. Prenez un tube capillaire en verre et placez-le sur une flamme de chalumeau pour le ramollir, puis étirez-le à différents diamètres (50 μm-500 μm). Coupez les pièces fines à l’aide d’un coupe-verre et polissez doucement l’orifice de la pointe avec du papier de verre en carbure de silicium de haute qualité. Après le nettoyage, raccorder l’extrémité épaisse du tube capillaire à un long tube et l’autre extrémité du tube à une aiguille de distribution et à une seringue de 5 ml (figure supplémentaire 1).
   REMARQUE : Les arêtes vives des coupes de tube de verre sont difficiles à insérer dans le tuyau ; Ainsi, la cassure doit être arrondie au bord de la flamme.
2. Fixez la seringue au pousse-seringue microfluidique et le tube capillaire à une extrémité au support. Connectez le clip d’extrémité haute tension rouge de l’alimentation haute tension à l’aiguille de distribution de la seringue et placez le clip argenté dans le liquide de collecte. Cette configuration crée un dispositif d’électropulvérisation microfluidique simple (Figure 1A).
   REMARQUE : Placez le tube capillaire perpendiculairement à la table.

3. Préparation des microsphères ALG

1. Placez les boîtes de collecte séparées contenant différents ions métalliques directement sous le tube capillaire. Allumez le pousse-seringue microfluidique et sélectionnez Avance rapide pour amorcer le tube avec l’ALG, puis réglez le débit approprié (2 mL/h).
2. Allumez l’interrupteur d’alimentation haute tension et tournez le bouton pour régler la tension appropriée (5-7 kV).
3. Ajouter 20 mL de solution dans chacune des boîtes de Pétri de 90 mm pour recueillir les microsphères d’ALG afin de former des ALGMS réticulées avec différents ions métalliques (figure 1B).
4. L’ALG forme des microsphères sous l’action du champ électrique et de la gravité dans différentes solutions de collecte d’ions en quelques secondes. Aspirez les microsphères à l’aide d’une pipette stérilisée et transférez-les dans des tubes à centrifuger individuels de 1,5 mL pour obtenir des microsphères d’hydrogel Zn²⁺, Ca²⁺, Cu²⁺ et Fe³⁺ -ALG (figure 1C). Étiquetez les tubes Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS et Fe-ALGMS.
   REMARQUE : Des microsphères de différents diamètres peuvent être obtenues en ajustant des paramètres tels que la tension, le diamètre de la pointe, le débit et la concentration de la solution.
5. Prenez une petite quantité des microsphères préparées, dispersez-les aussi uniformément que possible dans du PBS et placez-les sous un microscope pour les visualiser.
6. Sélectionnez au hasard 10 champs d’observation dans le même lot de microsphères, importez les images à mesurer dans le logiciel ImageJ, convertissez les images dans le mode de niveaux de gris approprié et utilisez la technologie de segmentation par seuil pour définir avec précision la surface des particules cibles et démarrer la fonction d’analyse des particules afin qu’ImageJ puisse identifier et mesurer les particules cibles. Obtenez des données sur les microsphères, puis importez-les dans le logiciel Origin pour l’analyse et la cartographie de la taille des particules.

4. Test de performance antimicrobienne

1. Préparer des suspensions de 5 mL de Staphylococcus aureus (S. aureus) et d’Escherichia coli (E. coli) avec une turbidité bactérienne initiale de 0,2 mcF à l’aide d’un milieu liquide Luria-Bertani (LB).
2. Ajouter 10 ml de chaque solution bactérienne dans 4 tubes à centrifuger stériles individuels de 15 ml. Ensuite, ajoutez 0,5 mL de Zn-ALGMS, Ca-ALGMS, Cu-ALGMS et Fe-ALGMS ALG dans chaque tube et placez-les dans un agitateur à température constante à 37 °C et 200 tr/min pendant 12 h. Ajoutez une quantité égale de solution saline au groupe témoin.
3. Diluez chaque solution bactérienne à 10^{à 5} fois avec de l’eau stérile. À l’aide d’une bille de verre stérile, étalez 200 μL de solution bactérienne sur un milieu solide LB.
4. Étalez la solution rapidement et uniformément sur la plaque de revêtement, en évitant les allers-retours dans la même zone. Ensuite, placez les plaques dans un incubateur à 37 °C pendant 12 h. Observez les colonies de différents groupes.
   REMARQUE : Toutes les procédures aseptiques doivent être effectuées à proximité d’une lampe à alcool. Stérilisez les récipients de culture microbienne, les ustensiles d’inoculation et les milieux de culture.

5. Tests de libération de médicaments

1. Pour évaluer la capacité de libération de différents microsphères, utilisez l’albumine sérique bovine (BSA) comme médicament modèle chargé. Ajouter 500 μL de chaque microsphère (Ca-ALGMS, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS et Fe-ALGMS) à 1 mg/mL de suspension BSA pendant 24 h.
2. Pour l’essai de libération de médicament, ajouter chaque échantillon saturé à 5,0 M de solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; pH 7,4), suivi d’une agitation pendant 15 min à 37 °C avec agitation continue à 80 tr/min.
3. Utilisez 100 μL de la solution et remplacez le milieu par un milieu frais à 1, 3, 6, 12, 24, 36 et 48 h.
4. Quantifier les concentrations de protéines surnageantes à des moments précis à l’aide d’une trousse d’analyse de la santé biologique conformément aux instructions du fabricant. Mesurez quantitativement le médicament libéré par un marqueur enzymatique pour obtenir l’absorbance correspondante et convertissez la valeur mesurée en concentration réelle du médicament selon la courbe standard. Calculez le taux de libération du médicament à l’aide de la formule suivante :
   Pourcentage de libération de la drogue = (concentration de la drogue libérée à un moment précis / concentration initiale de la drogue) x 100 %
5. À intervalles réguliers, retirez un volume égal de PBS de chaque puits et remplacez-le par un volume égal de milieu frais.

6. Test d’hémolyse

1. Placez les ALGMS Ca, Cu, Zn-ALGM et Fe préparés dans du PBS et incuberez-les à 37 °C pendant 24 h pour formuler la solution d’incubation.
2. Obtenir du sang total de souris BALB/c saines par phlébotomie oculaire, recueilli dans des tubes anticoagulants contenant du citrate de sodium. Vortex et centrifugeuse à 1509 x g pendant 15 min pour obtenir des globules rouges.
3. Rincez les globules rouges 2x-3x avec du PBS et préparez une solution de globules rouges à 10% avec du PBS.
4. Préparation de divers ALGM : Prendre 500 μL de chaque microsphère pour le groupe expérimental, 1 mL d’eau ultrapure (ddH₂O) pour le groupe témoin positif et 1 mL de solution PBS pour le groupe témoin négatif et mélanger chacun avec 20 μL de solution de cellules sanguines.
5. Incuber les échantillons à 37 °C pendant 4 h, centrifuger à 1509 x g, 15 min. Gardez le surnageant à l’écart et photographiez les globules rouges de chaque groupe après l’hémolyse.
6. Prenez le taux d’hémolyse du groupe témoin positif à 100 % et le groupe témoin négatif à 0 %. Mesurez les valeurs d’absorbance des surnageants dans chaque groupe et calculez le taux d’hémolyse à l’aide de la formule :
   Hémolyse (%) = (Valeurs d’absorbance des surnageants de chaque groupe-
   Valeurs d’absorbance de l’eau distillée seule) / (Valeurs d’absorbance du groupe témoin positif - Valeurs d’absorbance de l’eau distillée seule) x 100

7. Test de cytobiocompatibilité

1. Lavez les différents ALGM 2 fois avec du PBS et placez-les dans une boîte de Pétri de 5 ml pendant 15 min et jetez le surnageant.
2. Ajouter séparément différents ALGM à 0,2 mL dans un milieu de culture complet (DMEM) contenant 10 % de FBS, incuber à 37 °C pendant 24 h et filtrer la solution pour obtenir le lixiviat.
3. Cultivez les cellules NIH3T3 à une densité cellulaire d’environ 70 % dans des plaques de 24 puits, traitez les cellules NIH3T3 avec une solution de lixiviation de microsphères et poursuivez la culture avec un milieu complet pendant encore 24 h.
4. Retirez le milieu de culture cellulaire et lavez les cellules avec du PBS.
5. Évaluez la viabilité cellulaire à l’aide du test Calcein-AM/PI. Prendre 2,5 μL de solution de Calcein-AM (4 mM) et 12,5 μL de solution de PI (2 mM) et les ajouter à 5 mL de 1x PBS et bien mélanger pour obtenir une solution de travail avec 2 μM de Calcein-AM et 5 μM de PI.
6. Ajoutez la solution de travail sur des plaques de culture cellulaire préalablement ensemencées à 500 μL par puits, incubez à 37 °C sous protection lumineuse pendant 15 min, et observez et photographiez sous un microscope à fluorescence inversée. Configurez trois répétitions pour chaque groupe.
7. Calculez la viabilité cellulaire selon la formule suivante :
   Viabilité cellulaire (%) = nombre de cellules viables / (nombre de cellules viables + nombre de cellules mortes)

Résultats

Caractérisation d’ALGMS réticulés avec différents ions métalliques
La morphologie optique des ALGMS Ca-CA, Cu-ALGMS, Zn-ALGMS et Fe-ALGMS est illustrée à la figure 2, présentant une bonne sphéricité, une surface lisse, une distribution granulométrique uniforme (figure supplémentaire 2) et une excellente monodispersité. Nous avons ensuite effectué une caractérisation microscopique à l’aide de la microscopie électronique à balayage (ME...

Discussion

Dans ce protocole, nous présentons une méthode de préparation d’ALGMS basée sur la technologie de l’électropulvérisation microfluidique. La méthode est simple à utiliser et permet d’obtenir un grand nombre de microsphères avec une rondeur uniforme et un diamètre contrôlable. Cette approche est pratique pour les chercheurs et peut promouvoir la recherche et l’application de microsphères d’hydrogel. De plus, en se réticulant avec différents ions métalliques, la stabilité et la bioactivité des ALG...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
120 mesh screen	Solarbio,China	YA0946
Alcohol burner	Solarbio,China	YA2320
BALB/c mice	Wukong Biotechnology,China
Bicinchoninic Acid Assay reagent	Meilunbio,China	MA0082
Bovine Serum Albumin	Lablead,China	9048-46-8
CaCl2  powder	Aladdin,China	10043-52-4
Calcein-AM/PI	Biosharp,China	BL130A
Centrifuge tubes	Corning,America	430290
CuSO4  powder	Jnxinyuehuagong,China	7758-99-8
DMEM	Gibicol,China	C11995500BT
FeCl3  powder	Aladdin,China	7705-08-0
Fetal Bovine Serum	HAKATA,China	HN-FBS
Glass tubes	Sartorius,Germany	CC0028
Light microscopy	Evidentscientific,Japan	BX53(LED)
Microfluidic syringe pump	Longerpump,England	LSP01-3A
NIH3T3	HyGyte,China	TCM-C752
Petri dish	Thermofisher,America	150464
Phosphate buffer saline	Thermofisher,America	3002
Scanning electron microscope	Thermofisher,America	Axia ChemiSEM
Sodium alginate powder	Bjbalb,China	Y13095
ZnSO4 powder	Jnxinyuehuagong,China	7733-02-0