Transfert mitochondrial via des nanotubes à effet tunnel entre les cellules souches mésenchymateuses et l’épithélium pigmentaire rétinien in vitro

Résumé

Ici, nous présentons un protocole comprenant le traçage mitochondrial, les procédures de co-culture directe de cellules souches mésenchymateuses (CSM) et de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (ARPE19), ainsi que les méthodes d’observation et d’analyse statistique de la formation de nanotubes à effet tunnel (TNT) et du transfert mitochondrial pour caractériser l’échange mitochondrial via les TNT entre les CSM et les cellules ARPE19.

Résumé

Le transfert mitochondrial est un phénomène physiologique normal qui se produit largement entre divers types de cellules. Dans l’étude à ce jour, la voie la plus importante pour le transport mitochondrial est à travers les nanotubes à effet tunnel (TNT). De nombreuses études ont rapporté que les cellules souches mésenchymateuses (CSM) peuvent transférer des mitochondries à d’autres cellules par des TNT. Cependant, peu d’études ont démontré le phénomène de transfert mitochondrial bidirectionnel. Ici, notre protocole décrit une approche expérimentale pour étudier le phénomène de transfert mitochondrial entre les CSM et les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes in vitro par deux méthodes de traçage mitochondrial.

Nous avons co-cultivé des CSM transfectées par mito-GFP avec des cellules ARPE19 transfectées par mito-RFP (une lignée cellulaire épithéliale pigmentaire rétinienne) pendant 24 h. Ensuite, toutes les cellules ont été colorées à la phalloïdine et imagées par microscopie confocale. Nous avons observé des mitochondries à fluorescence verte dans les cellules ARPE19 et des mitochondries à fluorescence rouge dans les CSM, indiquant qu’un transfert mitochondrial bidirectionnel se produit entre les CSM et les cellules ARPE19. Ce phénomène suggère que le transport mitochondrial est un phénomène physiologique normal qui se produit également entre les CSM et les cellules ARPE19, et que le transfert mitochondrial des CSM vers les cellules ARPE19 se produit beaucoup plus fréquemment que l’inverse. Nos résultats indiquent que les CSM peuvent transférer les mitochondries dans l’épithélium pigmentaire rétinien, et prédisent de la même manière que les CSM peuvent réaliser leur potentiel thérapeutique par le transport mitochondrial dans l’épithélium pigmentaire rétinien à l’avenir. De plus, le transfert mitochondrial des cellules ARPE19 vers les CSM reste à explorer.

Introduction

Les mitochondries servent de source d’énergie principale pour la plupart des types de cellules, le dysfonctionnement mitochondrial ayant un impact particulier sur les tissus à forte demande d’énergie comme la rétine¹. Les altérations métaboliques de la rétine peuvent déclencher une crise bioénergétique, entraînant finalement la mort des photorécepteurs et/ou des cellules EPR². Les thérapies à base de cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont démontré leur efficacité dans le traitement de la dégénérescence oculaire, et l’un des mécanismes précis sous-jacents aux effets bénéfiques des CS....

Protocole

1. Génération de lignées cellulaires MSC-mito-GFP et ARPE19-mito-RFP

1. Culture cellulaire
   REMARQUE : Seuls les MSC sont utilisés ici à titre d’exemple.
   1. Cultivez des CSM humaines dans une plaque à 6 puits dans un milieu hMSC avec 1 % de pénicilline et de streptomycine (voir le tableau des matériaux) jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne 80 % à 90 %. En fonction de la densité de croissance cellulaire, changez le milieu une fois tous les 2-3 jours.
      1. Retirez le milieu d’origine et lavez une fois les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) (voir

Discussion

De nombreuses études ont démontré que le phénomène du transfert mitochondrial médié par le TNT est un processus physiologique répandu dans divers types de cellules tissulaires 10,11,12,13. Le don mitochondrial fonctionnel de CSM à des cellules présentant un dysfonctionnement mitochondrial présente un fort potentiel thérapeutique

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110
6-well plate	NEST	703001
15 mL centrifuge tube	BD Falcon	352097
24-well plate	NEST	702001
ARPE19 cells	ATCC	CRL-2302	Cell lines
Bovine serum albumin (BSA)	Beyotime	ST025
CellTrace violet	Invitrogen	C34557
Cover slide	NEST	801007
DMSO	sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
Fetal Bovine Serum (FBS)	VivaCell	C04002-500
FluorSave Reagent	Millipore	345789
MSCs	Nuwacell	RC02003	Cell lines
ncMission	Shownin	RP02010
Pen Strep	Gibco	15140-122
pCT-Mito-GFP	SBI	CYTO102-PA-1	Plasmid; From  https://www.systembio.com/mitochondria-cyto-tracer-pct-mito-gfp-cmv
Puromycin	MCE	HY-B1743A
Pipette	Axygen	TF-1000-R-S
Phalloidin	Invitrogen	A22287
Triton X-100	Solarbio	T8200
Transwell plate	Corning	3470