Méthode simplifiée d’isolement et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes de souris adultes

Résumé

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) agit comme une barrière cruciale entre la choroïde et la rétine, favorisant la santé et la fonction des types de cellules rétiniennes, telles que les photorécepteurs. Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour isoler et cultiver l’EPR murin adulte.

Résumé

Les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) sont essentielles au bon fonctionnement de la rétine. Le dysfonctionnement de l’EPR est impliqué dans la pathogenèse d’importantes maladies rétiniennes, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinite pigmentaire et la rétinopathie diabétique. Nous présentons une approche simplifiée pour l’isolement de l’EPR à partir d’yeux adultes murins. Contrairement aux méthodes précédemment rapportées, cette approche permet d’isoler et de cultiver des EPR très purs à partir de souris adultes. Cette méthode simple et rapide ne nécessite pas de compétences techniques approfondies et est réalisable avec des outils scientifiques et des réactifs de base. Les EPR primaires sont isolées chez des souris de fond C57BL/6 âgées de 3 à 14 semaines par énucléation de l’œil suivie de l’ablation du segment antérieur. La trypsinisation enzymatique et la centrifugation sont utilisées pour dissocier et isoler l’EPR de l’œilleton. En conclusion, cette approche offre un protocole rapide et efficace pour l’utilisation de l’EPR dans l’étude de la fonction rétinienne et de la maladie.

Introduction

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche cellulaire spécialisée qui tapisse la membrane de Bruch située entre les photorécepteurs et la choroïde¹. Les cellules EPR jouent un rôle essentiel dans le bon fonctionnement de la rétine. Les cellules EPR transportent le glucose et la vitamine A vers les photorécepteurs, favorisent la vision par réisomérisation de la rétine tout-trans en rétinienne 11-cis et maintiennent les segments externes du photorécepteur par phagocytose des segments externes excrétés, éliminent l’eau de l’espace sous-rétinien, forment la barrière hémato-rétinienne externe par la présence de jonctions serrées et s....

Protocole

L’utilisation de sujets animaux dans cette étude a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Case Western Reserve.

1. Préparation des réactifs

1. Préparez le milieu tampon de lavage en complétant la solution saline équilibrée de Hank (HBSS), sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol avec 10 mM de solution tampon HEPES. Maintenir la solution à 4 °C jusqu’à utilisation.
2. Préparez le milieu EPR en complétant le milieu Eagle’s modifié de Dulbecco avec 4,5 g/L de glucose, 1,25 fois le supplément GlutaMAX (concentration de base 100x ou 20....

Discussion

Dans cet article, nous avons décrit un protocole simplifié pour l’isolement et la culture de l’épithélium pigmentaire rétinien murin. Les cellules EPR isolées dans les yeux de souris adultes ont exprimé un marqueur spécifique de l’EPR, RPE65, et un marqueur de jonction intercellulaire, ZO-1. De plus, les cellules cultivées se sont développées en feuilles hexagonales pigmentées en culture.

Plusieurs méthodes d’isolement de l’EPR chez les rongeurs ont été publiées préc.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.009 RD Single-Edge Blades	Personna	941202
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Corning	10-013-CV	with 4.5 g/L glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
GlutaMAX, 100x	Gibco	35050061
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco	14175095	no Calcium, no magnesium, no phenol red
HEPES Buffer Solution (1M)	Gibco	15630106
MEM Non-Essential Amino Acids, 100x	Gibco	11140050
Micro-Unitome Knife	BVI Beaver	377546
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x	Corning	30-002-CI
Polystyrene Microplates	Falcon	08-772-1	24-well or 48-well
Regular Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200056	with phenol red
Vannas scissors	Fine Science Tools	10091-12