Étude de l’angiogenèse aux niveaux fonctionnel et moléculaire en exploitant le test de migration des plaies par égratignures et le test de germination des sphéroïdes

Résumé

Cette étude présente le test de migration bidimensionnel (2D) et le test de germination de sphéroïdes tridimensionnel (3D), ainsi que leurs méthodes d’analyse respectives en aval, y compris l’extraction d’ARN et l’immunocytochimie, comme des tests appropriés pour étudier l’angiogenèse in vitro.

Résumé

L’angiogenèse joue un rôle crucial dans les processus physiologiques et pathologiques du corps, y compris la croissance tumorale ou les maladies oculaires néovasculaires. Une compréhension détaillée des mécanismes moléculaires sous-jacents et des modèles de dépistage fiables sont essentiels pour cibler efficacement les maladies et développer de nouvelles options thérapeutiques. Plusieurs essais in vitro ont été mis au point pour modéliser l’angiogenèse, en capitalisant sur les possibilités qu’offre un environnement contrôlé pour élucider les facteurs angiogéniques au niveau moléculaire et rechercher des cibles thérapeutiques.

Cette étude présente des flux de travail pour l’étude de l’angiogenèse in vitro à l’aide de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC). Nous détaillons un test de migration de plaie par égratignure à l’aide d’un système d’imagerie de cellules vivantes mesurant la migration des cellules endothéliales dans un cadre 2D et le test de germination de sphéroïdes évaluant la germination de cellules endothéliales dans un cadre 3D fourni par une matrice de collagène. De plus, nous décrivons des stratégies de préparation des échantillons pour permettre d’autres analyses moléculaires telles que la transcriptomique, en particulier dans le cadre de la 3D, y compris l’extraction d’ARN ainsi que l’immunocytochimie. Dans l’ensemble, ce cadre offre aux scientifiques un ensemble d’outils fiables et polyvalents pour poursuivre leurs recherches scientifiques dans les essais d’angiogenèse in vitro .

Introduction

L’angiogenèse, qui fait référence à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants¹, est un processus crucial au cours du développement physiologique et des conditions pathologiques. Il est indispensable pour fournir de l’énergie aux tissus hautement métaboliquement actifs tels que la rétine² ou le système nerveux central en développement³ et lors de la cicatrisation des tissus endommagés⁴. L’angiogenèse anormale, en revanche, est à la base de nombreuses maladies. Les tumeurs solides, comme le cancer colorectal ou le cancer du poumon non à petites cellules, facilitent leur croissance et l’apport énergétique nécessaire en favorisant l’angiogenèse⁵. Outre le cancer, les maladies néovasculaires de l’œil comme la rétinopathie diabétique ou la dégénérescence maculaire liée à l’âge, qui représentent les principales causes de cécité dans le monde développé, résultent d’une croissance aberrante des vaisseaux ^6,7. Une compréhension détaillée du mécanisme pathologique sous-jacent est cruciale pour comprendre comment l’angiogenèse physiologique peut être améliorée, par exemple, dans la cicatrisation des plaies tout en contrôlant mieux les conditions pathologiques telles que les maladies oculaires vasoprolifératives.

Au niveau cellulaire, les cellules endothéliales vasculaires sont activées par diverses molécules de signalisation dans l’angiogenèse, initiant la prolifération et la migration cellulaires⁸. Les cellules s’organisent ensuite en une hiérarchie, les cellules de pointe non proliférantes formant des filopodes sur le bord d’attaque de la branche⁸ du vaisseau en développement. À côté, des cellules pédonculaires à prolifération rapide suivent les cellules de pointe, contribuant à la formation du vaisseau émergent. Par la suite, d’autres types de cellules, telles que les péricytes ou les cellules musculaires lisses, sont recrutés pour stabiliser davantage la branche naissante⁹.

Pour explorer les processus moléculaires au niveau des cellules endothéliales vasculaires, de nombreux protocoles in vitro ont été développés et récemment examinés¹⁰. Ces tests se répartissent généralement en deux catégories : les approches 2D plus simplistes mais évolutives et les protocoles 3D plus élaborés. Dans le cadre d’un projet récent, nous avons effectué une analyse comparative complète entre l’essai de migration des plaies par égratignures 2D et l’essai de germination des sphéroïdes^{3D 11} afin d’évaluer l’étendue de leurs différences et leur capacité à modéliser divers aspects de l’angiogenèse¹².

Bien que les deux offrent l’avantage d’être fiables et facilement mis en œuvre, au niveau moléculaire, le test de germination de sphéroïdes 3D était favorable pour aborder des aspects clés de l’angiogenèse par rapport aux données in vivo, tels que les commutateurs métaboliques ou les interactions cellule-matrice. Étant donné que les essais d’angiogenèse in vitro sont utilisés pour évaluer le potentiel angiomodulateur des voies de signalisation¹³ et pour dépister des agents thérapeutiques, la transférabilité des résultats in vitro aux contextes in vivo est essentielle. De plus, la possibilité d’effectuer des analyses omiques sur les niveaux d’ARN et de protéines pour caractériser les changements moléculaires en réponse à la modulation ciblée des processus angiogéniques dans des conditions contrôlées reste un avantage important par rapport aux environnements in vivo ^14,15.

Dans cette publication, nous présentons des tests clés pour explorer les questions liées à l’angiogenèse grâce à l’utilisation d’un test de migration d’imagerie de cellules vivantes et d’un test de germination de sphéroïdes, y compris des analyses moléculaires ultérieures telles que le séquençage de l’ARN pour l’analyse transcriptomique et l’immunohistochimie au niveau des protéines.

Protocole

1. Culture cellulaire HUVEC

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions de travail stériles (banc de travail stérile).

1. Expansion des HUVECs
   1. Pour les deux tests d’angiogenèse, utilisez des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) ou des cellules endothéliales microvasculaires humaines (HMVEC).
   2. Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent 90 % de confluence dans un ballon T75 non enrobé avec un milieu de croissance cellulaire endothéliale (EGM) avant d’effectuer une séparation. Effectuez un changement moyen 3 fois par semaine.
      REMARQUE : Pour accélérer la croissance, le milieu peut être changé quotidiennement. N’utilisez pas les HUVECs au-delà du sixième passage. L’étude a reçu les résultats les plus cohérents en exécutant toutes les expériences avec des HUVEC du même passage.
2. Fendre les HUVECs
   1. Lorsque les HUVEC atteignent la confluence souhaitée dans la fiole T75, rincez-les une fois avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis incubez les cellules avec de la trypsine à 0,5 % pendant 2 min dans l’incubateur.
      REMARQUE : Une exposition prolongée à la trypsine peut endommager la fonction HUVEC.
   2. Détachez doucement les cellules en tapotant sur la fiole. Confirmez le décollement réussi à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé.
   3. Ajouter 8 mL d’EGM, transférer la solution dans un tube et granuler les cellules par centrifugation à 250 x g pendant 3 min.
   4. Si le comptage des cellules est nécessaire, remettre les cellules en suspension dans 5 mL d’EGM et utiliser une chambre Neubauer. Sinon, ajoutez 40 ml d’EGM et répartissez-le dans 4 flacons de culture cellulaire T75 frais.

2. Essai de migration des plaies par égratignure

REMARQUE : L’essai de migration par égratignures nécessite une durée de 3 jours (Figure 1). Effectuez toutes les étapes suivantes dans des conditions de travail stériles (banc de travail stérile).

1. Placage et affamation des cellules (jour 1)
   1. À l’aide d’une plaque spécialisée de 96 puits pour l’imagerie de cellules vivantes, ensemencez 20 000 HUVEC dans 100 μL d’EGM par puits. Laissez les cellules se stabiliser pendant 6 h dans l’incubateur.
      REMARQUE : Il est conseillé d’optimiser le nombre de cellules en tenant compte de la vitesse variable de croissance des cellules endothéliales vasculaires entre les fournisseurs et les laboratoires. L’objectif est d’obtenir une monocouche parfaite le lendemain avant d’initier le scratch. Les puits surpeuplés peuvent modifier le comportement des cellules endothéliales, par exemple par l’inhibition de contact¹⁶, tandis qu’une monocouche incomplète entrave considérablement l’analyse.
   2. Affamez tous les puits pendant la nuit avec 100 μL d’EBM par puits complété par 2% de FBS.
      REMARQUE : Veillez à ne pas endommager la monocouche cellulaire, en particulier lors de l’utilisation d’une pipette multicanaux.
2. Préparation des solutions de stimulation (jour 2)
   1. Diluer les substances et les contrôles souhaités dans le milieu basal de croissance des cellules endothéliales (EBM) complété par 2% de FBS. Pour chaque puits, utilisez 100 μL de solution.
      REMARQUE : L’EBM complété par 2 % de FBS sert de témoin négatif, tandis que le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire humain (VEGF) recombinant à 25 ng/mL peut être utilisé comme témoin positif. À l’aide de plaques de 96 puits, il est recommandé de concevoir les expériences avec un minimum de répétitions techniques (4 puits dans des conditions identiques), bien qu’il soit suggéré d’en utiliser 8 pour des résultats optimaux. Efforcez-vous de minimiser les effets potentiels sur les bords ou les coins lors de la planification de l’aménagement.
3. Création du scratch (jour 2)
   1. Vérifiez les cellules au microscope pour vérifier une monocouche cellulaire confluente et la viabilité cellulaire. Positionnez la plaque à 96 puits dans un outil de bobinage à 96 puits et générez la rayure en appuyant sur le levier de l’appareil. Soulevez avec précaution le couvercle de l’outil de fabrication de plaies avant de relâcher le levier pour éviter les doubles rayures.
   2. Lavez tous les puits deux fois avec 200 μL d’EBM par puits complété par 2 % de FBS. Confirmez au microscope que les débris ont été enlevés avec succès.
4. Stimulation cellulaire (jour 2)
   1. Ajouter 100 μL des solutions de stimulation ou de contrôle préparées par puits.
5. Imagerie (jours 2-3)
   1. Acquérez des images une fois par heure pendant une période allant jusqu’à 24 h à l’aide d’un programme automatisé fourni par le microscope d’imagerie sur cellules vivantes.
      REMARQUE : Pour assurer une bonne qualité d’image, balayez chaque puits immédiatement après l’avoir transféré dans l’incubateur abritant le système d’imagerie de cellules vivantes. Un temps d’acclimatation de 30 minutes dans l’incubateur permet d’obtenir une meilleure qualité d’image. Le logiciel du microscope est programmé pour acquérir une image par heure pour chaque puits situé sur la ligne médiane de l’égratignure définie.
6. En l’absence d’un outil de fabrication de plaies et d’un imageur de cellules vivantes, suivez les étapes décrites ci-dessous.
   1. Utilisez une pointe de pipette dans une plaque de 24 puits pour induire une égratignure. Prenez des images avec un microscope de culture cellulaire classique à des intervalles précis. À cette fin, utilisez un microscope motorisé équipé de capacités de suivi x et y précises. Cela permet un positionnement automatique, assurant une capture d’image cohérente à des endroits prédéfinis.
      REMARQUE : Lorsque l’imagerie manuelle est nécessaire, il est possible de n’imager que T0 ainsi qu’un point temporel 'x' heures après le traitement. Dans le protocole décrit utilisant des HUVEC, le point temporel T12 (12 h après la stimulation) était un point temporel attrayant avec une séparation claire entre le contrôle négatif et le contrôle positif stimulé par le VEGF. Cependant, il est recommandé d’effectuer des expériences initiales d’imagerie toutes les 2 h ou 1 h afin de déterminer le point temporel optimal pour les paramètres expérimentaux spécifiques de chaque laboratoire.
7. Analyse (jour 3)
   1. Le logiciel du microscope imageur de cellules vivantes peut permettre une analyse directe des images acquises. Définissez des masques délimitant les zones de pelouse cellulaire, d’égratignure initiale et de densité relative de la plaie. Déterminez les limites des cellules en fonction des différences de contraste.
      REMARQUE : Un ajustement de segmentation de 1,6, un fichier de trous de 500 μm², une taille ajustée de 1 pixel, une zone > 500 μm et une excentricité >0,6 ont été utilisés pour les expériences menées avec des HUVECs. Un contrôle visuel approfondi des paramètres de détection des cellules par rapport aux images réelles est essentiel. Grâce à des configurations optimisées, le logiciel calcule automatiquement la densité relative de l’enroulement (RWD) au fil du temps et génère les graphiques temporels correspondants avec l’écart-type (SD) des répliques techniques. Ces données peuvent ensuite être utilisées pour l’analyse statistique.

3. Extraction de l’ARN avec des cellules cultivées en 2D

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes jusqu’à l’étape 3.3 dans des conditions de travail stériles (banc de travail stérile).

1. Cellules de placage (jour 1)
   1. Détachez les HUVEC conformément à l’étape 1.2 du protocole de culture cellulaire HUVEC.
   2. Ensemencez 50 000 cellules par puits dans une plaque de 12 puits avec 2 ml d’EGM par puits.
   3. Changer le milieu après 6 h en EBM contenant 2% de FBS (milieu affamé) pour mourir de faim pendant la nuit.
2. Traitement des cellules (jour 2)
   1. Agents dilués d’intérêt en EBM complétés par 2% FBS. Remplacez le milieu affamé par la dilution préparée et incubez les cellules pendant le temps souhaité dans un incubateur.
3. Extraction de l’ARN (jours 2-3)
   1. Lyser les cellules avec 750 μL de Trizol par puits et incuber pendant 10 min sur un agitateur orbital.
   2. Remettez les échantillons en suspension à l’aide d’une pipette de 1000 μL à quelques reprises, puis stockez-les dans des tubes d’ARN spécifiques à faible liaison (volume 1,5 mL). Conserver à -80 °C.

4. Immunocytochimie avec des cellules cultivées en 2D

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes suivantes jusqu’à l’étape 4.4 dans des conditions de travail stériles (banc de travail stérile).

1. Préparation des lamelles
   1. Incuber 100 lamelles d’un diamètre de 12 mm dans de l’hydroxyde de potassium à 5 % dans du méthanol dans un tube de 50 mL pendant 30 min tout en agitant la solution appliquée.
      REMARQUE : Il s’agit d’une étape très importante dans la déprotonation de la surface des lamelles et l’amélioration des conditions d’enrobage et de culture. À ce stade, il est fortement recommandé de s’assurer que les lamelles sont bien réparties dans le support et qu’elles ne sèchent pas et ne sont pas collées ensemble.
   2. Lavez les lamelles pendant 30 min 4 fois avec de l’eau déminéralisée.
   3. Après le lavage, transférez-les dans une solution isopropylique à 70 % pour le stockage.
2. Revêtement des lamelles
   1. Appuyez les lamelles individuellement contre la paroi d’une boîte de Pétri carrée pour permettre l’évaporation de l’alcool isopropylique.
   2. Après 5 minutes, transférez les lamelles dans une plaque de 24 puits (une lamelle par puits). Appliquer 1 mL d’une solution de 10 mg/mL de collagène I dans du PBS dans chaque puits et incuber pendant 60 min à 37 °C.
   3. Ensuite, lavez les lamelles 4 à 5 fois pendant 5 minutes avec du PBS.
3. Culture des cellules
   1. Détachez les HUVEC en suivant les procédures décrites à l’étape 1.2 du protocole de culture cellulaire HUVEC.
   2. Ensemencez 50 000 cellules par puits dans une plaque de 24 puits avec 2 ml d’EGM par puits.
   3. Après 6 h, changez le milieu en EBM contenant 2% de FBS pour permettre aux cellules de se fixer au puits et affamer les cellules pendant la nuit.
   4. Le lendemain, les agents dilués d’intérêt dans l’EBM ont été complétés par 2% de FBS. Remplacez la solution affamée dans les puits par la dilution préparée et incubez les cellules pendant le temps souhaité dans un incubateur.
4. Fixation et blocage
   1. Cultivez les cellules pendant le temps souhaité, puis lavez les cellules avec du PBS pendant 5 min.
   2. Fixez les cellules avec 2% de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS pendant 20 min à température ambiante (RT).
   3. Laver avec du PBS 3-4 fois pendant 5 min.
   4. Incuber les échantillons avec un tampon bloquant contenant 5 % de sérum de chèvre normal (NGS), 0,1 % de Triton-X-100 dans du PBS pendant 1 h à RT.
      REMARQUE : À cette étape, il est important de laver les échantillons pour garantir l’élimination complète du PFA. Choisissez l’espèce du sérum en fonction de l’origine de l’anticorps secondaire.
5. Coloration
   1. Incuber les échantillons pendant la nuit à 4 °C dans le tampon de blocage avec l’anticorps primaire.
   2. Le lendemain, pour éliminer tout anticorps primaire non lié, lavez les échantillons 3 à 4 fois avec du PBS pendant 5 minutes chacun.
   3. Par la suite, incubez les échantillons pendant 1 h à RT avec l’anticorps secondaire correspondant et la phalloïdine-FITC, dilués ensemble dans le tampon de blocage.
   4. Lavez 3 à 4 fois supplémentaires.
   5. Retournez les lamelles sur les lames avec une petite gouttelette de support de montage contenant du DAPI, laissez sécher dans l’obscurité et scellez avec du vernis à ongles. Conservez les échantillons dans l’obscurité à 4 °C.

5. Essai de germination de sphéroïdes

REMARQUE : L’essai de germination des sphéroïdes prend 3 jours (figure 2). Effectuez toutes les étapes suivantes jusqu’à l’étape 5.7 dans des conditions de travail stériles (banc de travail stérile).

1. Génération de sphéroïdes dans des gouttes suspendues (jour 1)
   1. Détachez les HUVEC en suivant les procédures décrites à l’étape 1.2 du protocole de culture cellulaire HUVEC.
   2. Combinez 200 000 cellules avec 8 ml d’EGM et 2 ml de solution mère de méthocel, en assurant un mélange minutieux. Veuillez vous référer au fichier supplémentaire 1 pour obtenir des instructions sur la préparation de la solution mère de méthocel.
   3. Versez des gouttelettes de 25 μL de la solution sur la surface interne inversée d’une grande boîte de Pétri carrée. Faites pivoter doucement le couvercle de 180° et positionnez-le au fond du récipient de culture cellulaire de manière à ce que les gouttelettes pendent. Placez le récipient dans un incubateur de culture cellulaire pendant la nuit.
2. Préparation du gel de collagène (jour 2)
   1. Mélangez soigneusement 2,3 ml de collagène de queue de rat de type I avec 0,280 ml de 10x Medium 199 jusqu’à ce que le mélange obtienne une teinte jaune uniformément uniforme. Gardez ce mélange sur de la glace tout au long du processus.
3. Titrer le gel de collagène (jour 2)
   1. Titrer le mélange pour obtenir un pH physiologique, indiqué par une couleur orange, à l’aide de NaOH (2 N).
   2. Ajoutez 50 μL de tampon HEPES au produit final.
      REMARQUE : Pour assurer une plage dynamique optimale pour le dosage, il est impératif de s’approcher au plus près d’un pH physiologique. Différents lots de collagène peuvent nécessiter différentes quantités de NaOH. Gardez le mélange strictement sur de la glace tout au long du processus et mélangez-le uniformément tout le temps.
4. Récolte des sphéroïdes (jour 2)
   1. Rincer les gouttes suspendues des couvercles de culture cellulaire avec 20 ml de PBS.
   2. Centrifuger la solution pendant 7 min à 250 x g. Jetez le surnageant et remettez les sphéroïdes en suspension dans 0,1 mL de FBS et 0,4 mL d’EGM en tapotant doucement le tube.
   3. Ajouter 2 ml de solution mère de méthocel et bien mélanger. Utilisez une pipette d’une contenance minimale de 5 ml pour éviter d’endommager les sphéroïdes.
5. Ajout de sphéroïdes à la matrice de collagène 3D (jour 2)
   1. Ajouter 2 ml du mélange de collagène préparé aux sphéroïdes remis en suspension et bien mélanger.
   2. Versez 0,5 mL du mélange obtenu dans les puits d’une plaque à 24 puits et incubez dans un incubateur cellulaire pendant 30 min.
6. Stimulation des sphéroïdes dans une matrice de collagène 3D (jour 2)
   1. Préparez une dilution des substances souhaitées dans l’EBM. Pour chaque puits, utilisez 100 μL de solution.
      REMARQUE : L’EBM sert de contrôle négatif, tandis que le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) à 25 ng/mL (concentration finale dans 500 μL de matrice de collagène et 100 μL de couche d’EBM) peut être utilisé comme contrôle positif.
   2. Incuber pendant le temps souhaité.
      REMARQUE : Dans un test standard, il est recommandé de prendre 18 à 24 h, mais le temps doit être soigneusement optimisé dans chaque laboratoire.
7. Imagerie des sphéroïdes (jour 3)
   1. Utilisez un microscope inversé et une plate-forme d’imagerie pour capturer des images de tous les sphéroïdes qui ne sont pas en contact avec le bord du puits, les uns avec les autres ou qui montrent des signes de dommages. Maintenez des paramètres et des niveaux de zoom cohérents dans toutes les conditions.
8. Analyse (jour 3)
   1. Utilisez l’outil de mesure d’ImageJ Fiji pour déterminer la longueur de toutes les pousses de chaque sphéroïde dans chaque image.
      REMARQUE : Utilisez le plug-in fourni dans le fichier supplémentaire 2, ce qui rend l’analyse plus efficace et génère une sortie .txt fichier.
   2. Importez les données dans une feuille de calcul, R ou tout autre logiciel de votre choix, et utilisez la longueur cumulative moyenne de toutes les germinations par sphéroïde comme lecture pour chaque condition.
      REMARQUE : Les résultats de différents gels ne peuvent pas être combinés sous la forme de longueurs de germination absolues. Les données de chaque groupe de traitement doivent être normalisées en fonction du groupe témoin EBM ou VEGF (longueur de germination relative) avant de pouvoir fusionner les données.

6. Extraction d’ARN avec des cellules cultivées en 3D

1. Essai de germination de sphéroïdes
   1. Effectuez le test de germination des sphéroïdes comme décrit dans la rubrique 5.
2. Lyse du gel de collagène
   1. Lavez les gels sphéroïdes avec du PBS chaud pendant 5 min.
   2. Coupez les gels sphéroïdes en quartiers et transférez les 4 quartiers dans un tube de 50 ml. Utilisez un scalpel pour la dissection mécanique des gels.
   3. Traiter des échantillons de gel avec une solution de lyse (contenant 2 mg/mL de collagénase D dans du PBS) et incuber pendant 45 min à 37 °C sur un agitateur.
   4. Laver délicatement les gels avec du PBS complété par 2 mM d’EDTA pour stopper la réaction du tampon de lyse.
3. Extraction de l’ARN
   1. Remettre les gels lysés en suspension dans 750 μL de Trizol et incuber pendant 10 min pour garantir une extraction suffisante de l’ARN comme décrit à l’étape 3.3.
   2. Remettre les échantillons en suspension à l’aide d’une pipette de 1000 μL à quelques reprises et transférer les échantillons dans des tubes d’ARN spécifiques à faible liaison (volume 1,5 mL). Conservez les échantillons à -80 °C.

7. Immunocytochimie de sphéroïdes dans une matrice de collagène 3D

1. Essai de germination de sphéroïdes
   1. Effectuez le test de germination des sphéroïdes comme décrit dans la rubrique 5.
2. Fixation et blocage
   1. Fixez les gels avec 4% de PFA dans du PBS pendant 1 h.
      REMARQUE : Pour assurer une bonne fixation des cellules dans le gel, les gels doivent être soigneusement détachés sur les côtés des puits à l’aide d’un scalpel et d’une pince à épiler après un rinçage au PBS.
   2. Lavez doucement les gels 3 à 4 fois avec du PBS, puis détachez-les complètement de la surface des puits et transférez-les dans de nouvelles plaques à 24 puits.
   3. Incuber les gels pendant 1 h à RT avec la solution de blocage (contenant 5% de NGS et 0,1% de Triton-X-100 dans PBS) sur un agitateur orbital.
3. Coloration
   1. Incuber les échantillons pendant la nuit à 4 °C sur un agitateur orbital avec l’anticorps primaire dilué dans un tampon de blocage.
      REMARQUE : Le retournement des gels pendant cette incubation n’a pas amélioré la qualité de la coloration.
   2. Le lendemain, lavez doucement les gels 4 à 5 fois avec du PBS pendant 5 minutes chacun.
   3. Incuber l’anticorps secondaire correspondant, dilué avec de la phalloïdine-FITC dans un tampon de blocage pendant une nuit à 4 °C sur un agitateur orbitaire.
   4. Effectuez 4 à 5 étapes de lavage supplémentaires avec PBS.
   5. Transférez les gels sur des lames de microscope et montez-les avec deux gouttes de support de montage contenant du DAPI sur une lamelle placée sur chaque gel. Laissez sécher les échantillons avant de les sceller avec du vernis à ongles et conservez-les dans l’obscurité à 4 °C.
4. Microscopie
   1. Imagez tous les échantillons au microscope confocal. Utilisez l’objectif 20x et concentrez-vous sur la région qui vous intéresse. Acquérez des images sous forme d’empilements Z, ainsi que des images de plan focal individuel.
      REMARQUE : L’acquisition d’images de la pile Z et du plan focal à plusieurs sections de l’échantillon 3D est essentielle pour capturer la représentation complète, en particulier pour les échantillons 3D épais.

8. Cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMVEC)

REMARQUE : Toutes les étapes décrites peuvent également être réalisées avec des cellules endothéliales microvasculaires, par exemple des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMVEC). Dans ce cas, le milieu doit être remplacé par un milieu de cellules endothéliales microvasculaires spécifique contenant 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS) pour la culture ainsi que des étapes spécifiques de chaque essai. Les différences spécifiques au HRMVEC par rapport aux protocoles d’essai sont décrites ci-dessous :

1. Essai de blessure par égratignure
   1. Cultivez des cellules dans un milieu de cellules endothéliales microvasculaires FBS à 10 % au lieu de EGM.
   2. Ensemencer 20 000 cellules/puits.
   3. N’affamez pas les cellules pendant la nuit.
   4. Après avoir effectué le grattage, changez le milieu en milieu de cellules endothéliales basales contenant 5 % de FBS au lieu d’EBM avec 2 % de FBS.
2. Immunocytochimie des HRMVECs cultivés en 2D
   1. Cultivez les cellules dans un milieu de cellules endothéliales microvasculaires à 10 % au lieu de l’EGM.
   2. N’affamez pas les cellules pendant la nuit.
   3. Changez le milieu juste avant le traitement en EBM + 5% FBS au lieu de EBM + 2% FBS.
3. Essai de germination de sphéroïdes
   1. Ensemencez les cellules sous forme de gouttes suspendues avec un milieu cellulaire endothélial microvasculaire contenant 10 % de FBS au lieu d’EGM.
4. Immunocytochimie de sphéroïdes dans une matrice de collagène 3D
   1. Ensemencez les cellules sous forme de gouttes suspendues avec un milieu cellulaire endothélial microvasculaire contenant 10 % de FBS au lieu d’EGM.

Résultats

Pour l’essai de migration, il est crucial d’examiner minutieusement les images capturées au point temporel t = 0 h pour s’assurer que la présence d’une monocouche cellulaire entièrement formée est détectée avec précision par le système (Figure 1B). De plus, la clarté et la rectitude de la bordure scratch doivent être confirmées (Figure 1B). La zone sans cellules doit être en grande partie exempte de débris. À la fin de l’essai, un groupe ...

Discussion

Dans ce rapport, nous avons présenté un éventail de techniques avec des lectures fonctionnelles et moléculaires pour étudier l’angiogenèse in vitro.

Le test de migration représente une technique bien établie utilisée dans tous les domaines du travail de laboratoire humide. Nous avons choisi l’approche d’imagerie de cellules vivantes disponible dans le commerce pour tirer parti du format 96 puits adapté aux expériences de criblage et de dose-réponse, de la taille st...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Medium 199	Sigma-Aldrich	M0650
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)‘2-Fragment	Jackson IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK Optical Systems
Collagen Type 1 rat tail	Corning	354236
Collagenase D	Roche	11088858001
Endothelial Cell Basal Medium	Lonza	CC-3156	EBM
Endothelial Cell Growth Medium	Lonza	CC-3162	EGM
Ethylenediaminetetraacetic acid	Serva	11290.02	EDTA
Fetal bovine serum	Bio&SELL	S 0615	FBS
Human Umbilical Vein Endothelial Cells, pooled	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-well plates	Sartorius	4379
Incucyte S3 Live-Cell Analysis System	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
Microvascular Endothelial Cell Medium with 10% FBS	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate Labeled (0.5 mg/mL Methanol)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
Phosphate-buffered saline	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
Primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells	Cell Systems	ACBRI 181
ProLong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Invitrogen by ThermoFisher Scientific	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
recombinant human Vascular Endothelial Growth Factor	PeproTech	100-20	VEGF
Squared petri dish	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	Sartorius	4493