Immunocoloration intégrale et comptage automatique des cellules ganglionnaires rétiniennes de souris

Résumé

Ce protocole décrit la procédure d’isolement de la rétine de souris et d’immunomarquage pour marquer toutes les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR). Le processus est suivi d’une imagerie et d’un comptage automatique des CGR à l’aide d’un logiciel basé sur l’IA, offrant une méthode simple, rapide et précise pour quantifier les CGR dans l’ensemble de la rétine de la souris.

Résumé

Le glaucome est l’une des principales causes de cécité dans le monde, caractérisé par un mécanisme pathogène complexe qui rend difficile la restauration de la vision. Les souris servent de modèles animaux précieux pour l’étude de la pathogenèse et du traitement du glaucome en raison de leur patrimoine génétique relativement homogène et de leurs cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR), qui ressemblent structurellement à celles de l’homme. L’évaluation précise des lésions du CGR et des résultats du traitement dans les modèles de glaucome de souris nécessite de déterminer le nombre de CGR sur l’ensemble de la rétine. Ce protocole décrit une méthode complète impliquant l’isolement de l’ensemble de la rétine, le marquage des CGR avec des anticorps spécifiques et le comptage automatique rapide et précis des CGR à l’aide d’un programme basé sur l’IA. L’approche rationalisée permet une quantification efficace et précise du nombre de CGR dans les rétines de souris, facilitant ainsi l’évaluation de la dégénérescence du CGR et les interventions thérapeutiques potentielles. En permettant aux chercheurs d’évaluer l’étendue des dommages causés par le CGR, ce protocole contribue à une meilleure compréhension de la pathogenèse du glaucome et aide à développer des stratégies de traitement efficaces pour gérer et prévenir la perte de vision.

Introduction

Le glaucome se caractérise par la mort progressive des cellules ganglionnaires, ce qui pose un défi important pour la restauration de la vue ^1,2. Cette maladie est un axe majeur de la recherche ophtalmique en raison de sa prévalence et de son impact sur la vision³. Les modèles de souris sont indispensables dans le glaucome
recherche en raison de leur patrimoine génétique homogène, de leur capacité de reproduction élevée et de la similitude de leurs propriétés de cellules ganglionnaires avec celles de l’homme⁴. L’objectif princ....

Protocole

La procédure était conforme aux directives de l’Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie pour l’utilisation d’animaux dans la recherche et a été approuvée par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’hôpital populaire de la province du Sichuan. Des souris mâles C57Bl/6J (âgées de 2 mois) ont été utilisées dans cette étude. La figure 1 illustre la procédure générale décrite ici. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

1. Isolement des rétines e....

Discussion

Ce protocole fournit une méthode pour déterminer toutes les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) dans la rétine d’une souris, qui peut être utilisée pour surveiller la progression de la dégénérescence de la CGR dans des modèles murins pour les études sur le glaucome. La rétine de la souris est un tissu nerveux délicat⁵, et l’isolement des rétines entières des yeux de la souris nécessite une pratique répétée. Au cours de l’expérimenta.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1× PBS	Servicebio	G4202
Alexa594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG  (H+L)	ThermoFisher	A-11012
Anti-BRN3A antibody [EPR23257-285]	Abcam	ab245230
AutoCount software			https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs
Cloud disk	Google drive link		https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6
Cloud disk	Baidu link	Extraction code: g44k	https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg
Marker	Sharpie
Normal Donkey Serum	Biosharp, Labgic	25030081
Paraformaldehyde	Macklin	P804536
ProClean 300	Beyotime	ST853
Sucrose	BBI, Sangon	A610498
Triton X-100	BioFroxx, neoFroxx	1139ML100