L’ablation cellulaire au laser chez des larves de drosophile intactes révèle une compétition synaptique

Résumé

Ce protocole démontre l’ablation cellulaire au laser de neurones individuels chez des larves de drosophile intactes. La méthode permet d’étudier l’effet de la réduction de la compétition entre les neurones du système nerveux en développement.

Résumé

Le protocole décrit l’ablation d’un seul neurone avec un système laser à 2 photons dans le système nerveux central (SNC) de larves intactes de Drosophila melanogaster . En utilisant cette méthode non invasive, le système nerveux en développement peut être manipulé d’une manière spécifique à la cellule. Perturber le développement de neurones individuels dans un réseau peut être utilisé pour étudier comment le système nerveux peut compenser la perte d’entrée synaptique. Les neurones individuels ont été spécifiquement ablatés dans le système de fibres géantes de la drosophile, en mettant l’accent sur deux neurones : la fibre géante présynaptique (GF) et le motoneurone tergotrochantéral postsynaptique (TTMn). Le GF fait synapse avec le TTMn ipsilatéral, ce qui est crucial pour la réponse de fuite. L’ablation de l’un des GF dans le cerveau du 3e^stade, juste après le début de la croissance axonale, élimine définitivement la cellule pendant le développement du SNC. Le GF restant réagit au voisin absent et forme une terminaison synaptique ectopique au TTMn controlatéral. Cette terminaison atypique, à symétrie bilatérale, innerve les deux TTMn, comme le démontre le couplage des colorants, et entraîne les deux motoneurones, comme le démontrent les tests électrophysiologiques. En résumé, l’ablation d’un seul interneurone démontre une compétition synaptique entre une paire bilatérale de neurones qui peut compenser la perte d’un neurone et restaurer des réponses normales au circuit d’échappement.

Introduction

L’ablation au laser est un outil privilégié pour disséquer les circuits neuronaux dans une grande variété d’organismes. Développé dans des systèmes génétiques modèles comme les vers et les mouches, il a été appliqué dans tout le règne animal pour étudier la structure, la fonction et le développement du système nerveux ^1,2,3. Ici, l’ablation d’un seul neurone a été utilisée pour étudier comment les neurones interagissent lors de l’assemblage des circuits chez la drosophile. Le système d’échappement de la mouche est un circuit de prédilection pour l’analyse car il cont....

Protocole

Tous les animaux utilisés pour le protocole étaient de l’espèce Drosophila melanogaster. Il n’y a aucun problème éthique entourant l’utilisation de cette espèce. Une autorisation éthique n’était pas nécessaire pour effectuer ce travail. Les détails de l’espèce, des réactifs et de l’équipement de la drosophile utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Élevage de la drosophile et sélection du bon stade larvaire

1. Choisissez une ligne pilote Gal4 qui pilote l’expression dans les cellules à ablater et recombinez-la avec une ligne rapporteuse UAS-GF....

Discussion

L’ablation cellulaire à l’aide d’un microscope à 2 photons s’est avérée être une méthode très efficace pour manipuler le développement des circuits neuronaux chez la drosophile. Comme cette méthode est non invasive, elle cause des dommages minimes à l’animal. Les données soutiennent l’utilité de cette manipulation spécifique aux cellules de circuits connus.

Le choix du pilote Gal4 le plus approprié était crucial pour le succès de l’ablation. Comme le GFS .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jaxkson ImmunoResearch	111-545-003
Anti-green fluorescent protein, rabbit	Fisher Scientific	A11122	1:500 concentration
Apo LWD 25x/1.10W Objective	Nikon	MRD77220	water immersion long working distance
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	B4287-25G
Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser	Coherent
Cotton Ball	Genesee Scientific	51-101
Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby)	Fisher Scientific	D1817
Drosophila saline			recipe from Gu and O'Dowd, 2006
Ethyl Ether	Fisher Scientific	E134-1	Danger, Flammable liquid
Fly food B (Bloomington recipe)	LabExpress	7001-NV
Methyl salicylate	Fisher Scientific	O3695-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Eppendorf	22363204
Microscope cover-slip 18x18 #1.5	Fisher Scientific	12-541A
Neurobiotin Tracer	Vector Laboratories	SP-1120
Nikon A1R multi-photon microscope	Nikon		on an upright FN1 microsope stand
NIS Elements Advanced Research	Nikon		Acquisition and data analysis software
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	T353-500
PBS (Phosphate Buffered Salin)	Fisher BioReagents	BP2944-100	Tablets
R91H05-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	40594
shakB(lethal)-GAl4	Bloomington Drosophila Stock Center	51633
Superfrost microscope glass slide	Fisher Scientific	12-550-143
Triton X-100	Fisher Scientific	422355000	detergent solution
UAS-10xGFP	Bloomington Drosophila Stock Center	32185