Isolement mitochondrial robuste à partir de tissu cardiaque de rongeur

Résumé

Des études bioénergétiques et métabolomiques sur les mitochondries ont révélé leur rôle multiforme dans de nombreuses maladies, mais les méthodes d’isolement de ces organites varient. La méthode détaillée ici est capable de purifier des mitochondries de haute qualité à partir de plusieurs sources tissulaires. La qualité est déterminée par les rapports de contrôle respiratoire et d’autres paramètres évalués à l’aide de la respirométrie à haute résolution.

Résumé

L’isolement mitochondrial est pratiqué depuis des décennies, suivant des procédures établies par des pionniers dans les domaines de la biologie moléculaire et de la biochimie pour étudier les déficiences métaboliques et les maladies. Une qualité mitochondriale constante est nécessaire pour étudier correctement la physiologie mitochondriale et la bioénergétique ; Cependant, de nombreuses méthodes d’isolement publiées sont disponibles pour les chercheurs. Bien que différentes stratégies expérimentales nécessitent des méthodes d’isolement différentes, les principes et procédures de base sont similaires. Ce protocole détaille une méthode capable d’extraire des mitochondries bien couplées à partir de diverses sources tissulaires, y compris de petits animaux et des cellules. Les étapes décrites comprennent la dissection d’organes, la purification mitochondriale, la quantification des protéines et divers contrôles de qualité. La principale mesure de contrôle de la qualité utilisée pour identifier les mitochondries de haute qualité est le rapport de contrôle respiratoire (RCR). Le RCR est le rapport entre la fréquence respiratoire lors de la phosphorylation oxydative et la fréquence en l’absence d’ADP. D’autres indicateurs sont abordés. Bien que des valeurs RCR élevées par rapport à leur source tissulaire soient obtenues à l’aide de ce protocole, plusieurs étapes peuvent être optimisées pour répondre aux besoins individuels des chercheurs. Cette procédure est robuste et a toujours abouti à des mitochondries isolées avec des valeurs RCR supérieures à la moyenne dans les modèles animaux et les sources tissulaires.

Introduction

Les mitochondries sont des organites subcellulaires qui établissent des conditions énergétiques cytoplasmiques optimisées pour des fonctions cellulaires spécifiques. Alors que les études cellulaires, tissulaires et organisationnelles peuvent fournir des informations sur la fonction mitochondriale, l’isolement des organites offre un niveau de contrôle expérimental qui n’est pas possible autrement. Des isolements mitochondriaux sont effectués depuis les années 1940, ce qui permet d’étudier mécaniquement le métabolisme et la respiration dans une variété de cellules et de tissus ^1,2

Protocole

L’utilisation et le traitement de tous les animaux vertébrés ont été effectués conformément aux protocoles approuvés examinés et acceptés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université d’État du Michigan. Ce protocole a été conçu à l’aide de cobayes Hartley albinos mâles et femelles et de rats Sprague Dawley (SD). Pour l’isolement des mitochondries cardiaques de cobayes, des animaux ont été sacrifiés à des âges compris entre 4 et 6 semaines (300 à 450 g). Des mitochondries cardiaques de rats SD des deux sexes ont été obtenues entre l’âge de 10 et 13 semaines (250 à 400 g). Les recettes de tam....

Discussion

Le respect des méthodes décrites de manière concise dans ce protocole garantira l’isolement des mitochondries bien couplées du tissu cardiaque de petits rongeurs, en plus d’autres types et sources de tissus. Dans l’ensemble, le processus devrait durer de 3 à 3,5 heures, au cours desquelles tous les tissus animaux, les échantillons et les isolats devraient rester sur la glace à 4 °C autant que possible pour limiter la dégradation. Cette procédure est robuste et peut être .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glass beaker			For organ disection and mincing
50 mL centrifuge tubes			Centrifugation
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma	A5285	Respirometry assays
BSA Protein Assay Kit	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondrial protein quantification
Dextrose	Sigma	DX0145	For buffer (CB)
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E4378	For buffers (CB and IB) and respirometry assays
Glass cannula	Radnoti		Guinea pig and rat heart perfusion
Heparin sodium porcine mucosa	Sigma	SRE0027-250KU	Animal IP injection
High-resolution respirometer			Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers
Induction chamber
Isoflurane	Sigma	792632	Anesthetic
L-malic acid	Sigma	02288-50G	Respirometry assays
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	For buffer (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	For buffer (IB)
Microliter syringes			Sizes ranging from 5–50 µL
Microplate reader			Must be able to incubate at 37 °C
MOPS	Sigma	475898	For all buffers
O2 tank
OMNI THQ Homogenizer	OMNI International	12-500	Similar rotor stator homogenizers will work
pipettes			Volumes of  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
Potassium chloride	Sigma	P3911	For buffers (RB and CB)
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	For buffers (IB and RB)
Protease from Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Sodium chloride	Sigma	S9888	For buffer (CB)
Sodium pyruvate	Fisher bioreagents	BP356-100	Respirometry assays
Sucrose	Sigma	8510-OP	For buffer (IB)
Surgical dissection kit			Depends on animal and tissue source
Tabletop centrifuge			Must cool to 4 °C